Diferenciación inducida por estimulación eléctrica de células madre neurales y progenitoras

Comience con un chip microfluídico MOE conectado a un suministro eléctrico.

El chip contiene regiones de cultivo recubiertas de poli-L-lisina conectadas con puertos de entrada y salida, junto con electrodos de Ag/AgCl montados para conexiones eléctricas.

Coloque el chip microfluídico en un calentador para obtener condiciones óptimas de crecimiento.

Flujo de células madre y progenitoras neurales o NPC en las regiones de cultivo recubiertas a través de las salidas.

Las células interactúan electrostáticamente con la poli-L-lisina y se adhieren al dispositivo microfluídico.

A continuación, introduzca un medio de crecimiento que contenga factores de crecimiento que faciliten la proliferación de las células adheridas.

Aplique una corriente eléctrica a través de los electrodos de Ag/AgCl durante más tiempo con un suministro continuo de medio para la viabilidad celular.

La corriente eléctrica excita y activa las NPC, promoviendo la extensión de los procesos neuronales de los cuerpos celulares.

Además, la estimulación eléctrica desencadena varias vías de señalización intracelular.

Estas vías promueven que las NPC se diferencien específicamente en varias células neuronales, como neuronas, astrocitos y oligodendrocitos.

Para comenzar, dibuje patrones para capas individuales de PMMA y cinta adhesiva de doble cara utilizando el software adecuado. Encienda el trazador láser de dióxido de carbono y conéctelo a una computadora personal. Abra el archivo de patrón de diseño usando el software.

Coloque las láminas de PMMA o la cinta adhesiva de doble cara en la plataforma del trazador láser. Luego, enfoca el láser en la superficie de las láminas de PMMA o la cinta de doble cara con la herramienta de enfoque automático. Seleccione el trazador láser como impresora. Luego, use el trazador láser para comenzar la ablación directa en la hoja de PMMA o cinta adhesiva de doble cara.

Retire la película protectora de las láminas de PMMA y limpie la superficie con gas nitrógeno. Para unir varias capas de láminas de PMMA, apile tres piezas de láminas de PMMA de 1 milímetro y péguelas bajo una presión de 5 kilogramos por centímetro cuadrado en un adhesivo térmico durante 30 minutos a 110 grados Celsius para formar el conjunto del canal de flujo o estimulación eléctrica. Adhiera 12 piezas de adaptadores a las aberturas individuales en la capa uno del conjunto del chip MOE con pegamento de cianoacrilato de acción rápida.

Desinfecte los sustratos de PMMA de 1 milímetro, la cinta de doble cara y el PMMA de grado óptico de 3 milímetros mediante irradiación ultravioleta durante 30 minutos antes de ensamblar el chip. Adhiera los sustratos de PMMA de 1 milímetro en el PMMA de grado óptico de 3 milímetros con la cinta adhesiva de doble cara para completar el ensamblaje de PMMA. Adhiera el vidrio de cubierta limpio al conjunto de PMMA con la cinta adhesiva de doble cara.

Selle las aberturas de los adaptadores de puente de agar con tapones blancos apretados con los dedos. Conecte el conector de fondo plano al conjunto de chips MOE a través de los adaptadores de entrada y salida del medio. A continuación, conecte el adaptador cono-Luer a las llaves de paso de tres vías. Agregue 2 mililitros de solución de PLL al 0,01% con una jeringa de 3 mililitros que se conecte a la llave de paso de tres vías de la entrada del medio y conecte una jeringa vacía de 3 mililitros a la llave de paso de tres vías de la salida del medio.

Llene las regiones de cultivo celular con la solución de PLL y bombee lentamente la solución de recubrimiento hacia adelante y hacia atrás. Cierre las dos llaves de paso de tres vías para sellar la solución dentro de las regiones de cultivo. Incube el chip MOE a 37 grados Celsius durante la noche en una incubadora llena de una atmósfera de dióxido de carbono al 5%. Abra las dos llaves de paso de tres vías y elimine las burbujas en los canales bombeando manualmente la solución de recubrimiento hacia adelante y hacia atrás en el canal con las dos jeringas.

Extraiga 3 mililitros de medio completo en una jeringa de 3 mililitros que se conecte a la llave de paso de tres vías de la entrada del medio y agréguela para reemplazar la solución de recubrimiento en las regiones de cultivo celular. Reemplace el tapón blanco apretado con los dedos con el adaptador Luer e inyecte agarosa caliente al 3% para llenar el adaptador. Conecte la jeringa Luer-lock al adaptador Luer e inyecte agarosa caliente al 3% a través del tapón de goma negra para llenar la jeringa Luer-lock. Deje de 10 a 20 minutos para que la agarosa se enfríe y se solidifique.

Instale el chip MOE sembrado en celdas en el calentador ITO transparente que está sujeto a una etapa motorizada XYZ programable mantenida a 37 grados Celsius. Infunda los mNPC bombeando manualmente en el chip MOE a través de la salida del medio. Luego, incube el chip MOE sembrado en células en el calentador ITO durante 4 horas.

Utilice cables eléctricos para conectar un multiplexor EF al chip MOE a través de los electrodos del chip. Conecte un multiplexor EF y un generador de funciones a un amplificador para emitir pulsos de CC de onda cuadrada.