Generación de organoides cerebrales derivados de células madre pluripotentes inducidas

Tomemos colonias de células madre pluripotentes inducidas, o iPSC, cultivadas en una matriz de soporte.

Agregue una solución que contenga enzimas para disociar las colonias en células individuales.

Transfiera las células a un tubo, centrítelas y deseche el sobrenadante.

Vuelva a suspender las iPSC en un medio de crecimiento.

Transfiera las células a una microplaca que contenga fibras poliméricas biocompatibles.

Centrífuga para forzar la adición de iPSC, formando cuerpos embrioides, o EB, en el andamio polimérico.

Transición a un medio de inducción neural que promueve la proliferación y diferenciación de iPSC en células madre neurales, células progenitoras y neuronas inmaduras.

Tras la incubación, las células se autoorganizan.

Coloque los cuerpos embrioides en una hoja con hoyuelos y agregue gotas que contengan proteínas de la matriz extracelular.

Incubar para solidificar la matriz, incrustando los EB.

Transfiera los EB a una microplaca que contenga un medio de mantenimiento neuronal. Incubar.

Los EB experimentan proliferación celular para formar protuberancias y gemaciones y diferenciarse en neuronas maduras, formando organoides cerebrales.

Aspire el medio con una pipeta y lave las células una vez con DPBS. Luego, agregue 500 microlitros de solución de desprendimiento celular, o EDTA 0,5 milimolares, para disociar las colonias e incube a 37 grados centígrados durante 3 a 5 minutos. A continuación, agregue 1 mililitro de medios E8 nuevos a cada pocillo y pipetee suavemente para separar todas las células.

Transfiera toda la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 milímetros y agregue otro 1 mililitro de medios E8 frescos. Luego, gire las células a 290 g durante 3 minutos a temperatura ambiente.

Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el sedimento celular en 1 mililitro de medios E6, complementado con 50 inhibidores micromolares de ROCK, y cuente las células con un hemocitómetro.

Preparar una suspensión celular de la densidad de asentamiento deseada en medios E6, complementada con el inhibidor ROCK. Luego, agregue 150 microlitros de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de fijación ultrabaja de 96 pocillos.

A continuación, centrifugar la placa a 290 g durante 3 minutos a temperatura ambiente para forzar la agregación de las células. Luego, incube la placa a 37 grados Celsius en una atmósfera humidificada con 5% de dióxido de carbono para la formación del cuerpo embrioide.

Después de 24 horas de incubación, transfiera la placa a la campana y aspire cuidadosamente 120 microlitros del medio con una pipeta, teniendo cuidado de no aspirar el cuerpo embrioide bajando demasiado la punta de la pipeta en el pocillo.

A continuación, agregue 150 microlitros de medios E6 frescos, complementados con 2 micromolares XAV939 y los inhibidores de SMAD a cada pocillo. Transfiera la placa nuevamente a la incubadora y reemplace el medio diariamente con E6 recién preparado, complementado con los inhibidores.

En el séptimo día de incubación, verifique si todos los cuerpos embrioides han alcanzado un diámetro de 550 a 600 micrómetros y muestran un borde liso y claro. En esta etapa, están listos para ser incrustados en una matriz extracelular.

Para incrustar los organoides, prepare hojas de inclusión con hoyuelos colocando una lámina de película de sellado termoplástico de 4 pulgadas de largo en una caja P200 vacía. Luego use un tubo cónico de 15 mililitros, o un tubo de microcentrífuga de 500 microlitros, y presione suavemente la hoja de película hacia abajo en los orificios para hacer 12, o el número deseado de hoyuelos.

A continuación, rocíe etanol al 70% en la hoja de película y déjela secar dentro de la campana con la luz ultravioleta encendida durante al menos 30 minutos. Mientras tanto, descongele una cantidad suficiente de matriz de membrana basal en hielo. Luego, usando una punta P200 de diámetro ancho, transfiera un cuerpo embrioide de la placa de 96 pocillos a cada hoyuelo. Retire la mayor cantidad de medios posible con una punta de pipeta normal, pero no deje que el cuerpo embrioide se seque.

A continuación, con una punta P200 preenfriada normal, agregue aproximadamente 30 microlitros de matriz de membrana sin diluir a cada organoide, asegurándose de que el cuerpo embrioide esté lo más cerca posible del centro de la gota.

Una vez que todos los cuerpos embrionarios estén incrustados en la matriz, coloque la hoja de película en una placa de Petri estéril. Luego incube la placa de Petri a 37 grados Celsius durante 10 minutos en una atmósfera humidificada con 5% de dióxido de carbono para permitir que la matriz de la membrana se solidifique.

Para la diferenciación de organoides, agregue 5 mililitros del medio de diferenciación preparado con B27 sin vitamina A a un pocillo de una placa de 6 pocillos de fijación ultrabaja. Precaliente la placa a 37 grados centígrados en una incubadora. Una vez que la matriz de la membrana se haya solidificado, transfiera los cuerpos embrioides incrustados a la placa de 6 pocillos empujando los hoyuelos de la parte posterior de la hoja de película. Si es necesario, use 1 mililitro de medio del pocillo y pipetee sobre la hoja para separar las gotas de la hoja de película.