Una técnica de cocultivo indirecto neurona-astrocito para estudiar las interacciones neurona-glía

Comience con una placa de pocillos múltiples que contenga un inserto de membrana permeable recubierto con poli-D-lisina.

Agregue el medio de crecimiento de astrocitos al pocillo y siembre astrocitos, una célula glial especializada, en el inserto.

Incubar para permitir la adherencia celular a la poli-D-lisina a través de interacciones electrostáticas y formar una monocapa.

Reemplace el medio de astrocitos con un medio de cultivo de neuronas.

Transfiera este inserto a una placa de pocillos múltiples que contenga neuronas embrionarias primarias de ratón adheridas sobre un cubreobjetos recubierto de polímero.

Incubar para establecer un cocultivo indirecto de neuronas y astrocitos, donde los dos tipos de células están físicamente separados pero comparten el mismo medio de cultivo.

Los astrocitos secretan varios factores neurotróficos esenciales para la supervivencia y el crecimiento de las neuronas.

Estos factores migran a través del soporte permeable e interactúan con las neuronas primarias. Esto promueve su diferenciación y forma proyecciones neuronales.

Estas proyecciones se alargan y establecen conexiones sinápticas entre las neuronas, lo que indica interacciones neuronal-glial.

Cubra cada inserto con 10 microgramos por mililitro de poli-D-lisina e incube durante una hora. Después de una hora, lave los insertos dos veces con PBS.

Mientras tanto, aspire el medio de astrocitos y lave el cultivo una vez con 10 mililitros de PBS para asegurarse de eliminar el suero residual. A continuación, agregue 3 mililitros de tripsina EDTA al 0,05% a los matraces e incube las células para tripsinización durante aproximadamente 10 minutos. Luego, vuelva a suspender suavemente las células en 7 mililitros de medio astrocito.

Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros y centrifugue durante cinco minutos a 216 veces g. Luego, aspire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 1 mililitro de medio de astrocitos. Cuente las células usando una cámara de recuento. Posteriormente, llene la placa de 24 pocillos con 500 microlitros de medio de astrocitos por pocillo. Aspire el PBS y transfiera 25,000 células en 500 microlitros de medio de astrocitos a cada inserto individual, e incube el cultivo a 37 grados Celsius.

Para diseccionar el hipocampo, prepare tres platos de 10 centímetros llenos de medio de preparación y un tubo de 2 mililitros con 1 mililitro de medio de preparación. Disecciona los hipocampos de los restos de la corteza y recógelos en un tubo de 2 mililitros lleno de medio de preparación.

Es fundamental que el hipocampo se aísle sin tejido adyacente de otras regiones del SNC. Por lo tanto, después de extirpar el hipocampo, los tejidos contaminantes extraños deben eliminarse adicionalmente.

Después de la disección, transfiera el tubo a un banco de flujo laminar estéril. Retire el medio de preparación con cuidado y digiera el tejido del hipocampo con 1 mililitro de solución de digestión que contenga papaína. Después de 15 minutos de digestión, retire con cuidado la solución de digestión mediante una succión suave con una pipeta.

Debido a la alta sensibilidad de la neurona, es fundamental triturar el hipocampo con cuidado para evitar burbujas y obtener la intensidad de trituración óptima.

Lave el hipocampo tres veces con medio neuronal agregando y aspirando cuidadosamente 1 mililitro de medio de cultivo fresco por ciclo de lavado. Después del paso final de lavado, triture cuidadosamente el tejido en 1 mililitro de medio neuronal. Luego, cuente las células usando una cámara de conteo. Coloque 35,000 células en 500 microlitros de medio neuronal por pocillo de la placa de 24 pocillos e incube las neuronas a 37 grados Celsius durante una hora.

Ahora, saque de la incubadora los insertos preparados, que se han sembrado con monocapas de astrocitos confluentes. Intercambie el medio aspirando el medio de astrocitos y reemplazándolo con 500 microlitros de medio neuronal fresco.

Luego, coloque los insertos con astrocitos con cuidado en los pocillos que contienen los cultivos de neuronas usando fórceps estériles. Posteriormente, vuelva a colocar el cocultivo de astrocitos de neuronas indirectas resultante en la incubadora hasta los experimentos.