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Neurociencia
0 vistas • 4:51 min • July 8th, 2025
Corte la corteza de un ratón en trozos pequeños y transfiérala a un medio de disección fría que contenga una solución salina tamponada.
Agregue enzimas digestivas para disociar la matriz extracelular.
Para eliminar las enzimas residuales, lavar con el medio de disección en frío.
Reemplace este medio con un medio de enriquecimiento de astrocitos.
A continuación, use una pipeta para disociar las piezas de tejido.
Pasar la suspensión a través de un colador para eliminar el tejido no disociado y obtener células individuales.
Transfiera las células a una placa recubierta de polímero cargada positivamente. Incubar agitando.
Los astrocitos se adhieren firmemente, mientras que las neuronas, la microglía y los oligodendrocitos se desprenden
.El medio de enriquecimiento convierte los astrocitos maduros en astrocitos poligonales divisorios.
Retire las células desprendidas y lave los astrocitos con un tampón de fosfato.
Agregue enzimas digestivas para separar los astrocitos.
Agregue un medio que contenga suero para detener la actividad enzimática. Recoge los astrocitos en un tubo y centrífuga.
Deseche el sobrenadante. Resuspender las células en un medio de maduración de astrocitos para promover una estructura típica de astrocitos maduros en forma de estrella.
Corte cualquier tejido cortical que se utilizará para generar astrocitos en pedazos de no más de 1 milímetro cúbico. Una vez que se recolecten todas las piezas de tejido, espere a que se asienten en el fondo del tubo. Luego, aspire la mayor cantidad de medio posible. A continuación, añadir de 2 a 3 mililitros de tripsina EDTA al 0,05% e incubar las muestras en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 20 minutos.
Luego, aspire cuidadosamente la tripsina EDTA, dejando trozos de tejido en una cantidad mínima de líquido en el fondo del tubo. A continuación, agregue 5 mililitros de medio de disección preenfriado para lavar la tripsina EDTA restante y pipetee al costado del tubo superior para lograr la mezcla de las piezas de tejido. Luego aspire el medio de disección y deje los trozos de tejido en la menor cantidad de líquido posible.
Repita este paso de lavado con medio de disección preenfriado dos veces. Después del paso final de lavado, agregue 1 mililitro de DMEM PLUS a temperatura ambiente y titule el tejido pipeteando hacia arriba y hacia abajo sin introducir burbujas.
Los astrocitos son bastante sensibles al pH, por lo que es importante evitar producir burbujas, ya que esto puede cambiar el pH de la solución.
A continuación, coloque un colador de células de 100 micras en la abertura de un tubo de 50 mililitros y humedezca previamente el filtro con 4,5 mililitros de DMEM PLUS preenfriado. Pipetee 1 mililitro de la suspensión de tejido disociado en el colador celular y agregue otros 4,5 mililitros de DMEM PLUS preenfriado para lavar las células a través de él. El día in vitro 7 después de la disección, coloque las placas de 10 centímetros con células en DMEM PLUS en un agitador en la incubadora y agite las placas a 110 RPM durante seis horas.
De 20 a 30 minutos antes del final de la agitación de seis horas, precaliente 1X PBS, DMEM PLUS, NB+H y tripsina EDTA al 0,25% a 37 grados en el baño de agua. Después de seis horas de agitación, retire las placas de cultivo de la coctelera y reemplace inmediatamente el medio con 10 mililitros de PBS 1X precalentado por plato. Posteriormente, retire el PBS y agregue 3 mililitros de tripsina EDTA precalentado por plato.
Luego, incube las muestras durante cuatro minutos a 37 grados centígrados. A continuación, agregue 5 mililitros de DMEM PLUS precalentado a 3 mililitros de tripsina EDTA en cada plato. Pipetea las células del plato y recoge la suspensión celular en un tubo de 50 mililitros. Después de eso, centrifugue la suspensión celular a 3.220 veces g a 20 grados Celsius durante cuatro minutos. Luego retire el sobrenadante, luego vuelva a suspender el sedimento celular en 1 mililitro de NB + H precalentado.