Desarrollo de un cocultivo de neuronas y macrófagos in vitro

Comience con neuronas ganglionares de la raíz dorsal murina aisladas en un medio de crecimiento.

Sembréelos en una placa de pocillos múltiples recubierta de polímero para promover la unión neuronal.

A continuación, tome un ratón eutanasiado diseccionado e inyecte PBS helado en su cavidad peritoneal.

Masajee suavemente el peritoneo para desalojar los macrófagos de la pared del peritoneo.

Apriete el ratón para recolectar el líquido peritoneal y trátelo con un tampón de lisis para lisar selectivamente los glóbulos rojos, que aparecen como contaminantes. Centrifugar y resuspender las células en un medio de cultivo.

Transfiera los macrófagos a un inserto poroso colocado dentro del pocillo que contiene las neuronas cultivadas.

Este cocultivo permite que las neuronas y los macrófagos estén muy cerca.

Tratar el cocultivo con db-cAMP e incubar para facilitar su entrada en las células. Esto activa las neuronas para secretar las moléculas de señalización.

Estas moléculas de señalización, junto con db-cAMP, inducen a los macrófagos a adoptar un fenotipo pro-regenerativo y secretar factores esenciales para el crecimiento neuronal.

Antes de configurar el cultivo, recubra previamente una placa de 6 pocillos con poli-D-lisina y laminina. A continuación, incube la placa de 6 pocillos con poli-D-lisina 0,01 a 37 grados Celsius durante dos horas o a 4 grados Celsius durante la noche. Después de eso, lave el plato dos veces con agua destilada.

Luego, incube la placa con solución de laminina a una concentración de 3 microgramos por mililitro durante dos horas a temperatura ambiente. Después de esto, lave el plato dos veces con agua destilada y séquelo a temperatura ambiente durante, al menos, una hora.

Ahora, haga una incisión en la piel que recubre la columna vertebral de un ratón sacrificado con una cuchilla quirúrgica y diseccione los músculos paravertebrales bilateralmente para exponer los huesos vertebrales. Retire los huesos vertebrales meticulosamente con un rondure quirúrgico de punta estrecha hasta que los DRG estén completamente expuestos.

Bajo un microscopio de disección, retire el DRG bilateralmente desde S1 hasta el nivel C1 con tijeras de iridectomía y fórceps de punta fina. Transfiera el DRG a un tubo Eppendorf de 1,5 mililitros utilizando una punta de pipeta azul con un extremo de corte.

Luego, retire el DMEM después de un centrifugado rápido durante varios segundos con una minicentrífuga. Agregue 1 mililitro de DMEM que contenga 125 unidades por mililitro de colagenasa tipo 11 e incube el tubo durante 90 minutos con una rotación suave usando un giro o agitador a 37 grados Celsius.

Luego, deseche el DMEM que contiene colagenasa y agregue 1 mililitro de DMEM fresco. Transfiera el DRG a un tubo cónico de 15 mililitros utilizando una punta de pipeta azul con un extremo de corte. A continuación, pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente, al menos, 15 veces para hacer una suspensión celular homogénea.

Centrifugar el tubo a 239 g durante tres minutos y desechar con cuidado el sobrenadante con residuos flotantes. Agregue 1 mililitro de medio neurobasal suplementado con B27 y vuelva a suspender el sedimento celular pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo de cinco a 10 veces.

A continuación, pase la suspensión celular a través de un colador celular de 70 micrómetros superpuesto sobre un tubo cónico de 50 mililitros. Luego, coloque todas las neuronas DRG recolectadas en dos pocillos de la placa de 6 pocillos.

Para preparar macrófagos peritoneales primarios de un ratón adulto, haga una incisión delicada en la piel abdominal para exponer el peritoneo y evite cortar el peritoneo para evitar la fuga de líquido de lavado.

A continuación, perfore el peritoneo con una jeringa con una aguja de calibre 22 e inyecte 10 mililitros de PBS helado en la cavidad peritoneal. Masajee suavemente el peritoneo durante uno o dos minutos. Luego, saque la aguja y exprima el PBS a través del sitio de punción de la aguja y recoja el líquido de lavado en un tubo cónico de 50 mililitros.

Luego, centrifugar el líquido de lavado a 239 g durante 10 minutos a 4 grados centígrados para granular los componentes celulares. Posteriormente, vuelva a suspender el gránulo con 3 mililitros del tampón de lisis de glóbulos rojos durante tres minutos a temperatura ambiente.

A continuación, centrifugar de nuevo la suspensión celular a 239 g durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Vuelva a suspender las células granuladas en 1 mililitro de medio neurobasal B27. Coloque la mitad de todos los macrófagos recolectados en un inserto de cultivo celular con un área efectiva de 4,2 centímetros cuadrados, que se coloca encima del pocillo de DRG disociado.

Cuatro horas después de que los macrófagos neuronales hayan sido cocultivados, agregue 2 microlitros de solución de AMP cíclico db-cyclic de 100 micromolares a los cocultivos de macrófagos neuronales. Después de 24 horas, llene un pocillo vacío con 1 mililitro de medio de cultivo de macrófagos en la misma placa de 6 pocillos.

Transfiera el inserto de cultivo celular en el cocultivo de macrófagos neuronales al pocillo vacío con medio de cultivo de macrófagos.