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Comience con monofosfato de adenosina cíclico, o cAMP, una molécula de señalización que regula varias funciones celulares. Agregue cAMP a un cocultivo de neuronas y macrófagos.
Las moléculas de AMPc del medio y los factores de crecimiento de las neuronas desencadenan la activación de macrófagos.
Transfiera el inserto con macrófagos activados a otro pocillo que contenga un medio de cultivo de macrófagos.
Aquí, los macrófagos liberan citocinas y quimiocinas en el medio, formando un medio condicionado o CM.
Centrifugar el CM para granular los componentes celulares.
Transfiera el sobrenadante y el filtro para eliminar los desechos celulares.
Agregue el MC recolectado a un cultivo neuronal. Las citocinas y quimiocinas en el CM recolectado promueven las extensiones neuronales.
Agregue paraformaldehído frío para fijar las células.
Agregue un tampón de bloqueo para evitar la unión inespecífica de anticuerpos. Lave para eliminar el tampón residual.
Aplicar anticuerpos primarios que se dirigen a las proteínas citoesqueléticas de las neuronas. Lavar para eliminar los anticuerpos no unidos.
Agregue anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo rojo que se unan a los anticuerpos primarios. Lavar para eliminar los anticuerpos no unidos.
Usando microscopía de fluorescencia, visualice las neuronas de color rojo con extensiones.
Cuatro horas después de que los macrófagos neuronales hayan sido cocultivados, agregue 2 microlitros de solución db-cAMP de 100 micromolares a los cocultivos de macrófagos neuronales. Después de 24 horas, llene un pocillo vacío con 1 mililitro de medio de cultivo de macrófagos en la misma placa de 6 pocillos.
Transfiera el inserto de cultivo celular en el cocultivo de macrófagos neuronales al pocillo vacío con medio de cultivo de macrófagos. Después de 72 horas, centrifugar el medio acondicionado con macrófagos a 239 g durante cinco minutos para eliminar los componentes celulares. Pase el sobrenadante a través de un filtro de 0,2 micrómetros para eliminar cualquier resto de desechos celulares.
En este procedimiento, recubra previamente un portaobjetos de cámara de 8 pocillos con poli D-lisina y laminina. A continuación, obtener las neuronas DRG adultas asociadas en medio neurobasal, suplementadas con B 27. Coloque 5 x 104 celdas por pocillo en un portaobjetos de cámara de 8 pocillos prerrecubierto.
A continuación, coloque el portaobjetos de la cámara en una incubadora a 37 grados centígrados durante dos horas, permitiendo que las células se adhieran al fondo. Luego, reemplace el medio de cultivo con un medio acondicionado descongelado que se precalienta a 37 grados centígrados. 15 horas después del recubrimiento inicial, retire el medio y lave las celdas con PBS una vez.
Luego, agregue 200 microlitros de solución de paraformaldehído al 4% helada a los pocillos e incube las células con la solución de paraformaldehído durante 20 minutos a 4 grados centígrados. Posteriormente, incubar las células fijadas con una solución de anticuerpos primarios, diluida con suero de cabra normal al 10% durante cuatro horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 grados centígrados. Luego, tome imágenes con un microscopio de fluorescencia para visualizar el crecimiento de neuritas.