JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 3:00 min • July 8th, 2025
Comience con una cámara microfluídica recubierta de polímero con pocillos proximales y distales conectados a través de múltiples microranuras.
En el pozo proximal, coloque tejidos embrionarios de la médula espinal de ratón ricos en neuronas motoras en desarrollo.
Complemente esto bien con un medio nutritivo. Incubar para permitir el crecimiento de las neuronas y la adherencia a la superficie recubierta de polímero.
Más tarde, agregue un medio nutritivo sin factor de crecimiento al pozo proximal.
En los pocillos distales, agregue un mayor volumen de medio nutritivo que contenga factores de crecimiento para crear diferencias de concentración y volumen.
Estas diferencias hacen que los axones, las proyecciones neuronales más largas, crezcan hacia los pozos distales a través de los microsurcos.
Agregue una solución de tinte fluorescente en ambos pocillos.
Las moléculas de colorante ingresan a las neuronas y tiñen las mitocondrias y los orgánulos ácidos en ambos extremos.
En las imágenes confocales en vivo, los orgánulos teñidos con fluorescencia se mueven en ambas direcciones entre los cuerpos celulares neurales y los axones, lo que confirma el transporte axonal en las neuronas motoras.
Deseche todo el medio del compartimento proximal del MFC. Recoge un solo explante de médula espinal con una pipeta en un volumen total de cuatro microlitros e inyéctalo lo más cerca posible de la cueva. Extraiga cualquier exceso de líquido del pocillo proximal a través de las salidas laterales. Repita el paso anterior dos veces más y asegúrese de que los explantes estén incrustados en el canal proximal. Lentamente, agregue 150 microlitros de medio SCEX al pozo proximal.
Un día después de la siembra, reemplace el medio SCEX en el compartimento proximal y agregue medio SCEX rico en el compartimento distal, manteniendo un gradiente de volumen de al menos 15 microlitros por pocillo entre los pocillos distal y proximal. Después de cuatro a seis días, los axones deben cruzar al compartimento distal y estar listos para las imágenes de transporte axonal.
Para etiquetar las mitocondrias y los compartimentos ácidos, prepare medio SCEX fresco con Mitotracker FM rojo oscuro de 100 nanomolares y LysoTracker rojo de 100 nanomolares, y agréguelo a las cámaras microfluídicas. Incube durante 30 a 60 minutos a 37 grados centígrados, luego lávelos tres veces con medio SCEX tibio. Continúe con la obtención de imágenes en vivo del transporte axonal, adquiriendo una serie de imágenes de lapso de tiempo de 100 a intervalos de 3 segundos con un total de 5 minutos por película.