Cultivo compartimentado de neuronas murinas primarias mediante chips microfluídicos de plástico

Tomemos un chip microfluídico de plástico que comprende depósitos y compartimentos somáticos, así como depósitos y compartimentos axonales, conectados por microsurcos.

Agregue una solución de recubrimiento previo para saturar los compartimentos y las ranuras, evitando que las burbujas de aire queden atrapadas.

Aspirar la solución, dejando los compartimentos principales llenos. Lavar con tampón.

Cubra los pocillos con un polímero sintético que facilite la adhesión neuronal. Lavar con tampón y agregar medios de cultivo para evitar que la viruta se seque.

Para sembrar una suspensión de neuronas del hipocampo de rata, aspire el medio.

Cargue la suspensión en los depósitos somáticos. Las neuronas entran y se unen al compartimento somático.

Agregue medios de cultivo neuronales a los pocillos e incube. Los factores de crecimiento presentes en los medios facilitan el crecimiento neuronal.

Gradualmente, las neuronas extienden sus axones, que crecen hacia el compartimento axonal a través de los microsurcos.

La estrechez de los surcos impide la entrada de cuerpos celulares neuronales, asegurando la separación física de las regiones somáticas y axonales.

Para comenzar, coloque un chip estéril de varios compartimentos en una placa de Petri. Agregue 100 microlitros de una solución de recubrimiento previo al pozo superior izquierdo del chip y deje que fluya a través del canal principal hacia el pozo contiguo. A continuación, llene el pocillo inferior izquierdo del chip con 100 microlitros de la solución de recubrimiento previo.

Esta vez, espere cinco minutos para permitir que la solución fluya a través de los microsurcos. Ahora, agregue 100 microlitros de la solución de recubrimiento previo al pozo superior derecho y deje que fluya a través del canal principal hacia el pozo contiguo. Después de 90 segundos, llene el pocillo inferior derecho con 100 microlitros de la solución de recubrimiento previo e incube el chip durante 10 minutos.

Incline con cuidado la punta de la pipeta lejos del canal principal y aspire la solución de cada pocillo. Luego, agregue inmediatamente 150 microlitros de PBS al pozo superior izquierdo y espere 1,5 minutos. A continuación, agregue 150 microlitros de PBS al pozo inferior izquierdo y espere cinco minutos para permitir que el líquido fluya a través de los microsurcos.

Luego, agregue 150 microlitros de PBS a los pocillos superior derecho e inferior derecho en ese orden. Después de 10 minutos, nuevamente, aspire el PBS y repita los pasos de lavado por segunda vez. Después del segundo lavado, aspire el PBS los pocillos como antes inclinando la punta de la pipeta lejos de la abertura del canal.

Luego, agregue 100 microlitros de 0,5 mg por ml de solución de poli-D-lisina en el pocillo superior izquierdo del chip. Espere 1 minuto y medio y luego, llene el pocillo inferior izquierdo con 100 microlitros de la solución de poli-D-lisina. Repita este proceso en la mitad derecha del chip. Cierre la placa de Petri, luego coloque el chip en una incubadora a 37 grados centígrados durante una hora.

Después de la incubación, enjuague el chip dos veces con PBS como se describió anteriormente. A continuación, aspire el PBS del dispositivo. Inmediatamente, agregue 100 microlitros de medios de cultivo celular en el pocillo superior izquierdo del chip. Después de 1 minuto y medio, agregue los medios al pozo inferior izquierdo.

Espere cinco minutos para permitir que el medio fluya a través de las microranuras y luego repita el proceso de llenado en el lado derecho del chip. Preparar una suspensión celular de neuronas disociadas del hipocampo de rata de acuerdo con los protocolos establecidos. Retire la mayoría de los medios en cada pocillo del chip, pero deje los canales llenos.

A continuación, cargue inmediatamente 5 microlitros de la suspensión celular en el pocillo superior derecho y otros 5 microlitros de suspensión celular en el pocillo inferior derecho. Al cargar las células, apunte la punta de la pipeta hacia el canal principal. Después de cargar las células, transfiera el chip a una platina de microscopio para asegurarse de que las neuronas estén en el canal principal.

Después de esperar 5 minutos para que las células se adhieran, agregue aproximadamente 150 microlitros de medios de cultivo neuronal a cada uno de los pocillos superior e inferior derecho. Luego, agregue 150 microlitros de medio a cada uno de los pocillos superior e inferior izquierdo. Cubra la placa de Petri y coloque el chip en una bandeja humidificada en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados.