Reprogramación Neuronal Directa de Astrocitos de Ratón en Neuronas

Comience con una placa de pocillos múltiples que contenga astrocitos genéticamente alterados. Estas células se adhieren a un cubreobjetos colocado en un medio de astrocitos.

Estas células modificadas genéticamente expresan factores de transformación que fuerzan su transición a neuronas. Este proceso se llama reprogramación neuronal.

Tome un medio de diferenciación neuronal que contenga moléculas específicas y el suplemento de B27. Juntos, estos componentes proporcionan nutrientes esenciales y factores para la diferenciación.

Reemplace el medio de astrocitos con el medio de diferenciación neuronal.

Incube los astrocitos durante un tiempo requerido.

Durante la incubación, los factores de transformación expresados por los astrocitos desencadenan una secuencia de eventos moleculares que permiten la conversión de un astrocito en una neurona.

Las neuronas convertidas tienen cuerpos celulares más pequeños y procesos alargados, similares a las neuronas típicas.

Prepare el medio de diferenciación neuronal agregando un mililitro de suplemento de B27 a 49 mililitros de medio de cultivo básico. Después de 24 a 48 horas, dependiendo de si las células han sido transducidas o transfectadas, reemplace el medio de astrocitos con un mililitro de medio de diferenciación neuronal por pocillo. Cultive las células a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 9%.

Para aumentar la eficiencia de reprogramación, complemente el medio de diferenciación neuronal con forskolina y dorsomorfina a una concentración final de 30 micromolares y un micromolar respectivamente al reemplazar el medio de astrocitos con el medio de diferenciación. Cuando opte por tratar las células con forskolina y dorsomorfina, proporcione una segunda dosis de dorsomorfina dos días después del tratamiento inicial. Añadir este segundo tratamiento directamente al medio de cultivo.