Preparación de cortes de cerebro en cuña para visualizar neuronas auditivas

Comience con un cerebro de ratón y diseccione horizontalmente debajo de la parte posterior para preservar las neuronas auditivas cruciales para el procesamiento del sonido.

Monte la sección posterior en un disco magnético. Coloque un bloque de agar para estabilizar el tejido durante el corte.

Transfiera la sección a la etapa de una cámara de corte de un vibratomo equipado con una cuchilla.

Introduzca un tampón frío y gas carbogenado de burbujas que proporcione oxígeno y preserve la integridad de las neuronas.

Haga un corte horizontal uniforme para eliminar la parte superior de la sección cerebral.

Luego, incline la platina y continúe cortando la sección restante hasta que la raíz del nervio auditivo sea visible.

Vuelva a alinear el escenario. A continuación, gírelo y ajuste la posición de la cuchilla para el grosor deseado del borde delgado de la rebanada.

Aleje la cuchilla y vuelva a alinear la platina a su posición anterior. Ahora, corta el cerebro en forma de cuña, más grueso por un lado y más delgado por el otro.

El lado más grueso incluye la raíz nerviosa auditiva, mientras que el lado más delgado presenta neuronas auditivas interconectadas.

Comience usando una hoja de afeitar para cortar la piel en la línea media del cráneo desde la nariz hasta la parte posterior del cuello. Retire la piel para exponer el cráneo y, comenzando en la base del cráneo y continuando hacia la nariz, use unas tijeras pequeñas para hacer una incisión en el cráneo a través de la línea media.

En la sutura lambda, haga cortes en el cráneo desde la línea media lateralmente hacia la oreja en ambos lados para pelar el cráneo y exponer el cerebro. Comenzando en el extremo rostral, use una pequeña espátula de laboratorio para levantar suavemente el cerebro del cráneo y permitir que se corten los nervios ópticos.

Continúe trabajando suavemente el cerebro hacia atrás, exponiendo la superficie ventral, y use fórceps finos para pellizcar con cuidado los nervios del trigémino cerca de la superficie ventral del tronco encefálico para cortarlos. Coloque la preparación en una placa de Petri de vidrio llena de solución fría para rebanar y coloque la placa bajo un microscopio de disección. Recorte los nervios faciales cerca del tronco encefálico para exponer los nervios vestibulococleares.

Use fórceps finos para empujar las puntas hacia los agujeros donde el nervio vestibulococlear sale del cráneo lo más lejos posible. Pellizque para cortar los nervios de ambos lados, dejando la raíz nerviosa unida al tronco encefálico.

Retire las meninges y la vasculatura de la superficie ventral del tronco encefálico cerca del cuerpo trapezoidal. Luego, pellizque los nervios craneales restantes y el tejido conectivo para liberar el cerebro completamente del cráneo, teniendo cuidado de preservar la médula espinal restante, si es posible.

Para preparar la superficie del cerebro para la fijación al escenario, coloque el cerebro con el lado ventral hacia arriba y use una herramienta roma para inmovilizar suavemente la médula espinal para estabilizar el tejido cerebral. Inserte fórceps abiertos en un ángulo de aproximadamente 20 grados a través del cerebro hasta el fondo del plato para que las puntas salgan de la superficie dorsal del cerebro caudal al quiasma óptico, y use una hoja de afeitar para cortar a lo largo de los fórceps.

A continuación, prepare un bloque de un centímetro cúbico de agar al 4% y extienda una pequeña gota de pegamento en un rectángulo sobre el escenario. Use fórceps para levantar con cuidado el cerebro y frote suavemente el exceso de líquido con el borde de una toalla de papel. Luego, coloque la superficie bloqueada sobre el pegamento de modo que la superficie ventral mire hacia la dirección de la cuchilla durante el corte, y empuje suavemente el bloque de agar contra la superficie dorsal como soporte.

Para adquirir cortes de cuña con la raíz del nervio coclear en el lado grueso y las neuronas mediales, olivocochleares y el núcleo medial del cuerpo trapezoidal en el lado delgado, coloque el disco magnético con el cerebro conectado en el soporte de la platina y coloque el soporte en la cámara de corte de un vibratomo con la superficie ventral del cerebro orientada hacia la hoja. Llene la cámara con una solución de rebanado helada y baje la cuchilla a la solución con burbujas de carbógeno.

Corte las rodajas caudales a la región de interés para asegurarse de que las rodajas sean simétricas. Luego, mueva el escenario aproximadamente 15 grados hacia un lado. Continúe cortando con cuidado hasta que la raíz del nervio auditivo esté cerca de la superficie de un lado y el nervio facial se pueda ver en la superficie del otro lado de la rebanada.

Vuelva a colocar la platina 15 grados en la posición original y aleje la cuchilla del tejido. Gire la base de la platina 90 grados para que el borde lateral del lado delgado quede hacia la cuchilla y baje la cuchilla varios cientos de micras antes de acercar lentamente la cuchilla al borde del tejido. Con la cuchilla ligeramente retraída, baje la cuchilla al grosor deseado del borde delgado de la rebanada.

Mueva la cuchilla hacia atrás del tejido y gire la base de la platina hacia atrás para que la superficie ventral mire hacia la base de la platina. Haga un corte para designar la superficie rostral de la rebanada de cuña y transfiera la rebanada a una hoja de papel de interfaz de un centímetro cuadrado. superficie caudal hacia abajo.

El nervio facial debe ser visible en ambos hemisferios de la rebanada en la superficie rostral. Luego, mueva la rebanada a una cámara de incubación de 35 grados Celsius para que se recupere durante 30 minutos.