Generación de cultivos primarios de ganglios angulares de la retina a partir de embriones de pez cebra

Comience con embriones de pez cebra en etapa temprana de desarrollo en medios embrionarios.

Retire el corion, la membrana protectora que rodea a los embriones, y transfiera los embriones a una placa de cultivo fresca que contenga medios.

Retire la parte de la cola del embrión, luego separe la cabeza y separe suavemente los ojos de la cabeza.

Los ojos contienen la retina, una capa delgada de tejido que alberga las células ganglionares de la retina.

Transfiera los ojos a un tubo que contenga medios de cultivo de células de pez cebra.

Disociar mecánicamente los ojos para liberar las células ganglionares de la retina y formar una suspensión unicelular.

Tome cubreobjetos colocados en una placa de cultivo que contenga medios de cultivo de pez cebra.

Los cubreobjetos están recubiertos con un polímero sintético y una proteína de adhesión.

Transfiera las celdas al centro del cubreobjetos e incube.

Las células ganglionares de la retina se adhieren a las superficies recubiertas y, además, estas células desarrollan proyecciones largas llamadas axones.

Recupere los embriones de pez cebra de la incubadora y sumérjalos en una placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros que contenga etanol al 70%, durante 5 a 10 segundos para esterilizarlos. Con una pipeta de transferencia, transfiera los embriones al plato E2 Media #1 que contiene medios E2 estériles para eliminar el exceso de etanol. Luego, transfiera los embriones a la placa E2 Media # 2 y retire sus coriones con pinzas afiladas. Finalmente, transfiera los embriones a la placa E2 Media # 3 para realizar disecciones.

Con un par de pinzas finas, coloque y sostenga los embriones anteriores a la yema con una de las pinzas y retire la cola posterior al saco vitelino con las otras pinzas. Agarra el cuello con fórceps y quítale la cabeza para exponer el cerebro y los ojos a los medios E2. Con la punta de unas pinzas finas, gire suavemente los ojos desde la cabeza mientras sujeta el tejido craneal hacia abajo con las segundas pinzas. Transfiera cuatro ojos a uno de los tubos previamente preparados que contienen ZFCM+.

Triture suavemente hacia arriba y hacia abajo con la pipeta P20 unas 45 veces para disociar las células. Transfiera el ZFCM+ con las celdas disociadas al centro de los cubreobjetos. Mantenga los cultivos en la mesa de trabajo a 22 grados centígrados, en una rejilla de espuma de poliestireno para absorber las vibraciones. El día de la obtención de imágenes, verifique las células bajo el microscopio para validar el crecimiento de los axones RGC.