Preparación de cultivos de rebanadas flotantes a partir de un cerebro humano adulto

Tome un tejido cerebral humano sumergido en una solución de corte. El pH biológico y los nutrientes de la solución ayudan a mantener la funcionalidad del tejido.

Retire la capa más externa de las meninges y recorte el tejido para crear una superficie plana.

Seque el exceso de solución del tejido. Fije el tejido recortado a un disco de muestra con un bloque de agarosa, manteniendo el tejido en contacto con el bloque para facilitar el seccionamiento.

Coloque el disco en una bandeja tampón de vibratomo y cubra el pañuelo con una solución para cortar helada.

Usando el vibratomo, genere cortes uniformes que preserven la arquitectura del tejido.

Recorte el exceso de tejido, asegurando una proporción constante de materia gris y blanca.

Coloque las rodajas en una placa multipocillos que contenga un medio de cultivo e incube.

Las rodajas permanecen suspendidas en el medio para garantizar un acceso uniforme a los nutrientes, una técnica conocida como cultivo de rodajas flotante

.

Reponga regularmente el cultivo con un medio suplementado con factor de crecimiento neural para mantener la viabilidad del tejido.

Transfiera la muestra a una placa de Petri que contenga una solución para rebanar. Con herramientas quirúrgicas finas, elimine con cuidado la mayor cantidad posible de meninges restantes. Elija la mejor orientación de la muestra para producir cortes con las características particulares del diseño experimental y use una hoja de bisturí número 24 para recortar una superficie plana para que sea la base que se pegará al disco de la muestra.

Con una cuchara de plástico desechable y pinceles delicados, recoja el fragmento de la placa de Petri y seque el exceso de solución con papel de filtro. A continuación, use superpegamento para unir el tejido a la placa de muestra de vibrátomo hasta que esté firmemente adherido a la placa y en contacto con el bloque de agarosa.

Coloque el disco de muestra de vibrátomo en la bandeja de almacenamiento intermedio de vibratomo. Bloquee el portacuchillos en su lugar con la hoja de afeitar firmemente fijada. Agregue solución para rebanar y asegúrese de que cubra tanto la muestra como la cuchilla. Luego, comience a cortar la muestra en rodajas de 200 micrómetros.

Transfiera las rodajas de la bandeja tampón a una placa de Petri que contenga una solución para rebanar y recorte los bordes sueltos y el exceso de materia blanca a una proporción de aproximadamente 70% de corteza y 30% de materia blanca. En una cabina de flujo laminar, agregue 600 microlitros de medio de cultivo a cada pocillo de una placa de 24 pocillos e incube a 36 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante al menos 20 minutos antes de sembrar las rodajas. Después de esto, use un pincel para colocar una rebanada en cada pozo.

Si hay pozos sin usar en la placa, llénelos con 400 microlitros de agua estéril. Incubar a 36 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Suplementar 10 mililitros del medio de cultivo previamente preparado con factor neurotrófico derivado del cerebro a una concentración de 50 nanogramos por mililitro.

Después de 8 a 16 horas, retire 333 microlitros del medio acondicionado de cada pocillo y agregue 133 microlitros de medio fresco suplementado con BDNF. Reemplace un tercio del medio acondicionado con medio fresco suplementado con BDNF cada 24 horas.