Aislamiento y cultivo de microglía a partir de cerebros de rata utilizando medios sin suero

Tomemos un cerebro de rata perfundido. Picarlo en pequeños fragmentos.

Homogeneizar el tejido en un tampón para liberar células, incluida la microglía.

Una vez que el tejido no digerido se asiente, recolecte las células que contienen sobrenadante y agregue un tampón de separación de mielina.

Mezcle el contenido y centrifugue para separar las células de la mielina y los desechos. Retire la capa de restos de mielina y el sobrenadante.

Vuelva a suspender las células en el tampón y la pipeta para separar los grupos.

Pasar la suspensión a través de un colador para eliminar los agregados celulares restantes.

Transfiera las células filtradas a una placa de cultivo recubierta con anticuerpos monoclonales específicos de la microglía. Incubar para facilitar la adhesión de la microglía.

Lavar con tampón para eliminar las células no adherentes. Agregue tripsina e incube para aflojar la microglía.

Eliminar la tripsina.

Agrega medios sin suero. Incubar en hielo para debilitar las interacciones célula-sustrato.

Pipetear y recoger la suspensión en un tubo. Centrifugar y eliminar el sobrenadante.

Vuelva a suspender la microglía en medios sin suero y transfiérala a una placa de pocillos múltiples recubierta de colágeno. Incubar para facilitar la adhesión de la microglía.

Agregue medios con factores de crecimiento y lípidos. Incubar para la maduración de la microglía.

Después de que los cerebros se hayan recolectado en DPBS frío, corte cada cerebro en trozos de un milímetro cúbico en una placa de Petri con hielo con una hoja de bisturí fría y transfiéralos a un homogeneizador Dounce helado con 5 a 7 mililitros de tampón de caída helado. A continuación, use un homogeneizador Dounce holgado para disociar el tejido con 10 a 20 movimientos suaves e incompletos. Tenga cuidado de no aplastar directamente el tejido en la parte inferior del homogeneizador. En su lugar, impulse el tejido a través del espacio entre los lados del pistón y el homogeneizador.

Es importante homogeneizar lentamente el tejido con múltiples rondas de douncing para preservar la viabilidad de la microglía.

Después, retire con cuidado el pistón para evitar la introducción de burbujas de aire. Deje que los trozos de tejido mal disociados se asienten en el fondo del homogeneizador y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros enfriado. Posteriormente, reemplace el volumen extraído con un tampón de confusión nuevo y repita el procedimiento de disociación durante un total de tres o cuatro rondas, o hasta que todo el tejido se haya disociado.

En este procedimiento, agregue un tampón de confluencia helado al tubo cónico de 50 mililitros que contiene la suspensión celular y ajuste el volumen total a 33,5 mililitros. A continuación, agregue 10 mililitros de MSB a la suspensión celular y mezcle bien invirtiendo el tubo varias veces. Esto dará como resultado una concentración final del 23% de MSB en un volumen de 43,5 mililitros.

Después de eso, centrifugue las células durante 15 minutos a 500 g a 4 grados centígrados con frenado lento. Luego, retire la capa superior de mielina y los desechos, y el sobrenadante con una pipeta. Tenga cuidado al quitar la capa superior para asegurarse de eliminar la mayor cantidad posible.

Después de eso, vuelva a suspender el gránulo celular en 12 mililitros de tampón de barrido. Triture suavemente la suspensión celular para romper los grupos de células restantes. En este paso, pase la suspensión celular a través de un colador celular de 70 micrómetros para eliminar los desechos grandes o los grumos celulares. Enjuague el plato de moldeo recubierto de OX42 tres veces con DPBS. No permita que la placa se seque completamente entre lavados.

Vierta el último lavado DPBS y aplique la suspensión celular filtrada al plato de barrido. Gire suavemente la placa para distribuir las células. Luego, incube la placa sobre una superficie plana a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir que las células se adhieran. No incube más de 20 minutos, o las células se volverán muy difíciles de recuperar del plato. Luego, enjuague el plato de moldeo con DPBS 10 veces para eliminar las células no adherentes.

La microglía se adherirá firmemente a la placa, así que gire la placa con cada enjuague para asegurarse de eliminar otras células no adherentes. Vierta el último lavado DPBS y reemplácelo con 15 mililitros de DPBS y 200 microlitros de tripsina.

Para tripsinizar las células, incube el plato durante menos o igual a 10 minutos a 37 grados centígrados. Después de 10 minutos de tripsinización, la microglía seguirá pegada a la placa. Vierta la mezcla y lave suavemente el plato dos veces con DPBS para eliminar la tripsina. Luego, reemplácelo con 12 mililitros de MGM helado.

Posteriormente, coloque el plato de moldeo en hielo durante dos minutos para ayudar a debilitar la interacción entre la célula y el sustrato, y asegúrese de que el plato esté plano para evitar que las áreas del plato de sartén se sequen. Después de eso, pipetee vigorosamente con una pipeta de 10 mililitros y un controlador de pipeta a alta velocidad para recuperar las células de la placa de moldeo. Dibuje una cuadrícula de 16 por 16 con el chorro de líquido de la pipeta para intentar eliminar todas las células.

Es importante encontrar un equilibrio entre la recuperación celular general y la salud de su cultivo. El pipeteo repetido de un sobrenadante celular contra la placa de barrido reducirá la viabilidad de su cultivo.

Revise las células bajo un microscopio con un aumento de 20x para asegurarse de que se hayan desprendido de la placa. Marque los puntos en la parte superior del plato donde están atascadas las células y repita el pipeteo en esas áreas. Recoja la suspensión celular y alícuota de 3 a 4 mililitros de sobrenadante en cada tubo cónico de 15 mililitros. Gírelo durante 15 minutos a 500 g a 4 grados centígrados con frenado lento.

Después de 15 minutos, aspire el sobrenadante, dejando 0,5 mililitros de MGM con el sedimento celular. Luego, vuelva a suspender cada gránulo en el MGM restante y agrupe las células de todos los tubos. Después de eso, cuente las células con el hemocitómetro.

Ahora, coloque 15 microlitros de recubrimiento de colágeno IV directamente en el centro de una placa de cultivo de tejidos aniónicos con recubrimiento catiónico de 24 pocillos e incube durante 15 minutos a 37 grados centígrados. Después de contar las células con un hemocitómetro, dilúyalas a 2,3 x ^10-5 por mililitro en MGM. Aspire el punto IV de colágeno e inmediatamente coloque 15 microlitros de suspensión celular en este punto para producir 3.5 x 10³ células por punto.

A continuación, incube durante cinco a diez minutos a 37 grados centígrados para permitir que las células se adhieran. Luego, agregue suavemente 500 microlitros de TIC equilibrado con CO₂ al pozo.