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Comience con un cerebro aislado. Sumerja rápidamente el cerebro en un líquido cefalorraquídeo artificial preenfriado o aCSF para pausar los procesos metabólicos.
El aCSF contiene NMDG, un catión orgánico grande que reduce la lesión y muerte de las células neuronales.
El aCSF también contiene HEPES, que mantiene el pH y la concentración de sal y previene la hinchazón y el daño celular.
Transfiera el cerebro a una placa de Petri que contenga un papel de filtro.
Recorta el cerebro para obtener la región deseada.
Fije el bloque cerebral en el portamuestras con un pegamento adecuado e insértelo en la agarosa.
Coloque el portamuestras en la cortadora.
Llene el depósito de la cortadora con el aCSF preenfriado y airee la solución para garantizar un suministro óptimo de oxígeno.
Obtenga secciones del bloqueo cerebral.
Transfiera las secciones al aCSF precalentado para reiniciar los procesos metabólicos, lo que permite que las secciones se recuperen.
Saque suavemente el cerebro intacto en el vaso de precipitados de NMDG-HEPES aCSF preenfriado y deje que el cerebro se enfríe uniformemente durante aproximadamente 1 minuto. Ahora, use una espátula grande para transferir el cerebro del vaso de precipitados a la placa de Petri, cubierta con papel de filtro.
Recorta y monta el cerebro, de acuerdo con el ángulo preferido de corte y la región cerebral deseada de interés. Trabaje rápidamente para evitar la privación prolongada de oxígeno durante la manipulación. Luego, fije el bloque cerebral al portamuestras, usando pegamento adhesivo.
Retraiga la pieza interior del portamuestras para retirar el bloqueo cerebral completamente hacia adentro. Luego, vierta la agarosa fundida directamente en el soporte hasta que el bloqueo cerebral esté completamente cubierto de agarosa. Posteriormente, sujete el bloque de enfriamiento de accesorios preenfriado alrededor del portamuestras durante 10 segundos hasta que la agarosa se haya solidificado.
Inserte el portamuestras en el receptáculo de la máquina cortadora y verifique la alineación adecuada. Después de eso, llene el depósito con el NMDG-HEPES aCSF preenfriado y oxigenado restante del vaso de precipitados de 250 mililitros y coloque una piedra de burbuja en el depósito durante el corte para garantizar una oxigenación adecuada.
A continuación, ajuste el micrómetro para comenzar a avanzar la muestra cerebral incrustada en agarosa. Inicie la cortadora y ajuste empíricamente la velocidad avanzada y la frecuencia de oscilación al nivel deseado. Continúe avanzando y cortando el tejido en incrementos de 300 micrómetros hasta que la región del cerebro de interés esté completamente seccionada. El tiempo total para el procedimiento de corte debe ser inferior a 15 minutos.
Para la recuperación inicial de NMDG, al finalizar el procedimiento de seccionamiento, recoja todas las rodajas con una pipeta Pasteur de plástico cortada y transfiéralas a una cámara de recuperación de 34 grados Celsius, llena con 150 mililitros de NMDG-HEPES aCSF.
El momento de la recuperación aguda de la espinilla cerebral es muy importante para poder lograr un equilibrio entre la preservación morfológica y la recuperación funcional de las propiedades electrofisiológicas de cada neurona.