Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 5:31 min. • July 8th, 2025
Comience con un cerebro de ratón en una matriz cerebral fría.
Obtenga secciones que contengan la zona subcallosa o SCZ. Transfiera la sección a un tampón de fosfato frío.
Bajo un microscopio de disección, corte la parte SCZ.
Pica el SCZ diseccionado en trozos más pequeños.
Transfiera estas piezas a un tampón de digestión. Incubar para disociar las células del tejido.
Centrifugar y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en un medio adecuado.
Transfiera las células a una placa de cultivo y agregue factores de crecimiento específicos.
Las células madre neurales adultas se dividen, formando grupos llamados neuroesferas.
La distribución inadecuada de nutrientes en los grupos celulares limita el crecimiento celular.
Para dispersar los racimos, centrifugar y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender los grupos en un tampón de disociación e incube.
Pipetee la solución hacia arriba y hacia abajo para generar células individuales.
Centrifugar y desechar el sobrenadante.
Vuelva a suspender las células y transfiéralas a un medio adecuado para obtener una monocapa.
Una vez diseccionado, transfiera el cerebro del ratón a un tampón PBS frío y enjuáguelo dos veces para eliminar el exceso de sangre. A continuación, coloque el cerebro en la matriz cerebral sobre hielo y haga cortes coronales para obtener rodajas de un milímetro de grosor. Posteriormente, transfiera los cortes cerebrales posteriores que contienen regiones SCZ a PBS frío.
Bajo un microscopio de disección con bajo aumento, microdiseccione la SCZ del área de materia blanca de la corteza y el hipocampo con una aguja doblada de calibre 30. Luego, retire las regiones de la corteza por encima de la SCZ y coloque la SCZ diseccionada en PBS frío en una placa de Petri de 35 milímetros con hielo.
La región de la zona subcallosa se puede diseccionar con precisión de todo el tejido utilizando una matriz cerebral y una aguja doblada de calibre 30.
Después de eso, retire el PBS y luego, corte inmediatamente los tejidos disecados en trozos pequeños. Vuelva a suspenderlos con un mililitro de tampón de digestión. Luego, transfiera la muestra a un tubo de 15 mililitros que contenga dos mililitros de tampón de digestión. Luego, incube durante 30 minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados.
En este paso, golpee suavemente el tubo para disociar el tejido digerido y luego centrifugue el tubo a 145 veces g durante cinco minutos. Después de cinco minutos, deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el tejido digerido con un mililitro de precalentado y dos medios para lavar el tampón de digestión y pipetee suavemente la solución de muestra un máximo de cinco veces.
A continuación, centrifugar la muestra de nuevo a 145 veces g durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el sedimento celular en un mililitro de medio N2. Coloque un mililitro de medio N2 en una placa de seis pocillos sin recubrimiento y agregue un mililitro de las celdas suspendidas para hacer un volumen final de dos mililitros.
A continuación, agregue 20 nanogramos por mililitro de EGF y 20 nanogramos por mililitro de bFGF en cada pocillo. Agite suavemente la placa de cultivo de seis pocillos a mano para mezclar los factores de crecimiento agregados con las células sembradas. Luego, mantenga la placa de seis pocillos en una incubadora de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.
Agregue 20 nanogramos por mililitro EGF y 20 nanogramos por mililitro bFGF a cada pocillo todos los días durante ocho días. Cada tercer día, agregue 200 microlitros de medios N2 para mantener aproximadamente dos mililitros del medio. Aquí hay una imagen de las neuroesferas después de ocho días.
En este procedimiento, reúna las neuroesferas y transfiéralas a un nuevo tubo cónico de 15 milímetros. Centrifugar el tubo a 145 veces g durante cinco minutos. Posteriormente, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las neuroesferas con 0,5 mililitros de tampón de disociación. Incubarlos con 0,5 mililitros de tampón de disociación durante cinco minutos en un baño de agua a 37 grados Celsius para disociar las neuroesferas en células individuales.
Pipetee suavemente la solución de muestra hacia arriba y hacia abajo menos de cinco veces, y centrifugue el tubo a 145 veces g durante cinco minutos. Posteriormente, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las neuroesferas con un mililitro de medio N2. Después de recubrir una placa de seis pocillos con laminina PLL, coloque las celdas a 2,5 x 105 celdas por mililitro con dos mililitros de medio N2 por pocillo. Mantener las células madre neurales adultas SCZ con un tratamiento diario de factores de crecimiento durante cinco días antes de pasarlas.