Generación de organoides cerebelosos maduros a partir de células madre pluripotentes inducidas utilizando biorreactores de un solo uso

Semilla de células madre pluripotentes inducidas por humanos, o iPSC, en un biorreactor. Las iPSC se resuspenden en un medio que contiene un inhibidor de la apoptosis celular.

Bajo un campo magnético, la rueda vertical del biorreactor gira a una velocidad controlada, lo que facilita el contacto célula-célula y la formación de agregados. Retire la mayor parte del medio y agregue medios nuevos sin el inhibidor.

Continúa cultivando. Una vez que los agregados alcancen un tamaño óptimo, déjelos asentarse por gravedad. Retire el medio.

Agregue medios de diferenciación que contengan factores de crecimiento y cultivo con una velocidad reducida de la rueda del biorreactor. Los factores de crecimiento promueven la diferenciación neuronal dentro de los agregados.

A continuación, agregue medio fresco complementado con factores de crecimiento y quimiocinas que induzcan el desarrollo de progenitores cerebelosos.

Gradualmente, los progenitores cerebelosos se organizan en distintas capas dentro de los agregados, formando organoides cerebelosos tempranos.

Finalmente, agregue un medio neuronal que contenga factores neurotróficos específicos.

Estos factores inducen la maduración del progenitor cerebeloso en neuronas cerebelosas funcionales sinápticamente activas, generando organoides maduros.

El día 1, siendo el día 0 el día de la siembra del biorreactor, coloque el biorreactor y la unidad base en una campana de flujo estéril. Luego, use una pipeta serológica para recolectar una muestra de 1 mililitro de la suspensión celular. Coloque la suspensión celular en una placa de 24 pocillos de fijación ultrabaja. Use un microscopio para confirmar que se han formado agregados derivados de iPSC. Si es así, capture imágenes de los agregados a 40x o 100x.

Continúe cultivando las iPSC en el biorreactor hasta que el diámetro promedio de los agregados sea de 100 micrómetros. A continuación, sustituya el 80% del medio por mTesR1 nuevo sin inhibidor de ROCK. Cuando los agregados alcancen de 200 a 250 micrómetros de diámetro, deje que todos los organoides se asienten en el fondo del biorreactor. A continuación, sustituya todo el medio gastado por el medio de diferenciación gfCDM.

Coloque la unidad base y el biorreactor en la incubadora y disminuya la agitación a 25 RPM.