Aislamiento de células inmunitarias infiltrantes de tumores de un cerebro murino

Tomemos un cerebro de ratón perfundido que contenga un tumor.

El paso de perfusión elimina las células inmunitarias circulantes pero retiene las células infiltradas por el tumor.

Aísle el tejido que contiene el tumor.

Ahora, disocia mecánicamente el tejido.

La fuerza mecánica afloja el tejido, liberando las células.

Transfiera el tejido disociado a un tubo.

Centrifugar y desechar el sobrenadante que contiene los residuos.

Vuelva a suspender el tejido en una solución de digestión que contenga colagenasa y ADNasa.

La colagenasa degrada la matriz extracelular, liberando las células. La ADNasa degrada el ADN contaminante.

Agregue un búfer para detener la actividad enzimática.

Filtre la suspensión para eliminar los agregados celulares y obtener una suspensión unicelular.

Centrifugar y desechar el sobrenadante.

Vuelva a suspender las celdas en un medio de gradiente de alta densidad. Ahora, superponga con un medio de gradiente de menor densidad, formando un gradiente de separación con una interfaz clara.

Centrifugar para separar capas. Las células inmunitarias se reúnen en la interfaz entre los medios de gradiente mientras los restos celulares flotan en la parte superior.

Recolecte las células inmunitarias para su posterior análisis.

En este procedimiento, con una cuchilla de afeitar limpia y de un solo filo, aísle el área del cerebro que contiene el tumor haciendo un corte sagital en el centro del cerebro para dividir los dos hemisferios. Gire el hemisferio ipsilateral hacia abajo y haga un corte coronal en el cerebelo y otro corte en el bulbo olfatorio para aislar el tejido diana que contiene el implante tumoral.

A continuación, coloque el tejido objetivo en el molinillo de tejido de vidrio hacia abajo etiquetado, que contiene 1 mililitro de DPBS. Empuje el émbolo completamente hacia abajo y gírelo siete veces para romper el tejido. Después de eso, levante el émbolo para permitir que el líquido se asiente nuevamente en el fondo del molinillo de tejidos. Repita este paso tres veces. Sin embargo, solo gire el émbolo cuatro veces durante las siguientes dos repeticiones y tres veces durante la última repetición para evitar triturar demasiado el tejido cerebral.

Posteriormente, aplique tres volúmenes de 1 mililitro de DPBS helado a los lados del émbolo para enjuagar la materia cerebral residual en el molinillo de tejidos. Luego, vuelva a suspender la materia cerebral triturada pipeteando hacia arriba y hacia abajo y colóquela en un tubo de centrífuga de 15 mililitros etiquetado en hielo. Enjuague los lados del molinillo de tejidos DAPS con 1 mililitro adicional de DPBS helado y agréguelo al mismo tubo de centrífuga de 15 mililitros.

Mantenga todos los tubos que contienen materia cerebral triturada en hielo, hasta que se hayan procesado todas las muestras. Luego, gire la materia cerebral triturada en los tubos de centrífuga de 15 mililitros a 740 veces g durante 20 minutos a 4 grados Celsius. A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender la materia cerebral granulada en 1 mililitro de una mezcla previamente preparada de enzimas digestivas colagenasa y ADNasa I.

Coloque los tubos de centrífuga de 15 mililitros en una gradilla de tubos de ensayo y colóquela en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 15 minutos, luego, agite suavemente las muestras dos veces durante el período de incubación moviendo los tubos para facilitar la desagregación del tejido.

Posteriormente, agregue 6 mililitros de DPBS helado a cada tubo para diluir las enzimas digestivas. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender y filtre el volumen total a través de filtros estériles de malla de nailon de 70 micras en nuevos tubos de centrífuga etiquetados de 15 mililitros sobre hielo.

Luego, gire la suspensión de células cerebrales a 740 veces g durante 20 minutos a 4 grados Celsius para lograr un gránulo unicelular. Retire los tubos de 15 mililitros de la centrífuga y colóquelos en hielo. Luego, aumente el ajuste de temperatura en la centrífuga a aproximadamente 21 grados centígrados en preparación para el siguiente paso.

A continuación, retire completamente el sobrenadante celular e inicialmente vuelva a suspender los gránulos celulares en 1 mililitro de medios de centrifugación con una densidad del 70%, utilizando una micropipeta P1000. Luego, agregue cuatro mililitros adicionales de medios de centrifugación de densidad del 70% a cada tubo. Coloque las tapas de forma segura y homogeneice la suspensión celular invirtiendo suavemente el tubo varias veces.

Después de eso, transfiera los tubos de centrífuga de 15 mililitros, que contienen células cerebrales resuspendidas en medios de centrifugación de densidad del 70% del hielo a un tubo de ensayo a temperatura ambiente. Uno a la vez, superponga cuidadosamente 2 mililitros de solución de medios de centrifugación de densidad al 37% sobre los 5 mililitros de medios de centrifugación de densidad al 70% para formar una interfaz limpia entre las dos capas de medios de centrifugación de densidad.

Luego, marque la posición de la interfaz entre las dos capas con un marcador de punta fina para que pueda identificarse fácilmente después de la centrifugación cuando la distinción se vuelva menos evidente. Gire los tubos de centrífuga de 15 mililitros a 740 veces g durante 20 minutos a temperatura ambiente sin interrupción para evitar interrumpir la interfaz entre las capas de medios de centrifugación de densidad.

Después, recoja los PBMC que se han acumulado en la interfaz entre las dos capas de medios de centrifugación de densidad introduciendo una micropipeta P200 en el tubo, evitando cuidadosamente la capa lipídica. Una vez al nivel de la banda de PBMC, extraiga lentamente 200 microlitros de la superficie de la capa de medios de centrifugación de densidad del 70% y transfiéralos a un tubo FACS de polipropileno etiquetado respectivamente sobre hielo. Repita este paso una vez para lograr un volumen total de 400 microlitros por muestra.