Eliminación selectiva de la microglía de un cultivo de neuronas de gránulos cerebelosos de rata

Tome un cerebelo de rata cosechado y córtelo en fragmentos.

Transfiera los fragmentos a un tubo que contenga tripsina e incube.

La tripsina digiere la matriz extracelular del tejido, aflojando las neuronas granulares cerebelosas, así como las células no neuronales como la microglía y los astrocitos.

Agregue un tampón que contenga un inhibidor de tripsina y ADNasa. El inhibidor inactiva la tripsina mientras que la ADNasa degrada el ADN contaminante.

Centrifugar y desechar el sobrenadante.

Vuelva a suspender el tejido en un tampón que contenga el inhibidor y la ADNasa, y disociarlo mecánicamente para formar una suspensión unicelular.

Superponga la suspensión sobre una solución tampón que contenga proteínas.

Centrifugar y desechar el sobrenadante que contiene restos celulares.

Vuelva a suspender las células en el medio y siembre en cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina para facilitar la unión celular.

Retire el medio. Lave las células con medios nuevos y luego agregue medios que contengan un inhibidor del ciclo celular para prevenir la proliferación de células gliales.

Reemplace la mitad del medio con medios nuevos que contengan un inhibidor de lisosomas.

El inhibidor se dirige selectivamente a la microglía y altera las membranas lisosomales, causando la muerte microglial y la eliminación del cultivo.

Comience este procedimiento recolectando el cerebelo de cachorros de rata de cuatro a siete días de edad. Colóquelos inmediatamente en una placa de Petri que contenga cinco mililitros de solución A en hielo. Luego, retire el exceso de solución del cerebelo y coloque el pañuelo en la tapa de la placa de Petri. A continuación, corte finamente el tejido con una hoja de afeitar bien flameada en al menos tres direcciones diferentes.

Posteriormente, agregue el pañuelo picado a la solución B. Colóquelo en un baño de agua a 37 grados centígrados durante cinco minutos y agítelo suavemente cada dos minutos. Luego, agregue 20 mililitros de solución D al tubo para neutralizar la tripsina. Agitar y centrifugar a 65 g durante cinco minutos. Luego, vierta el sobrenadante. Vuelva a suspenderlo en cuatro mililitros de solución C.

Triturar la muestra 10 veces con cada una de las tres pipetas de vidrio flameado de diámetro decreciente hasta que la suspensión sea lo más homogénea posible. A continuación, agregue lenta y suavemente unas gotas de este homogeneizado sobre el BSA-EBSS. Si comienza a hundirse a través del BSA-EBSS, triture más y agregue un poco más de solución C. El homogeneizado debe asentarse en una capa encima del BSA-EBSS.

Gírelo a 100 g durante cinco minutos y no lo agite. Luego, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en un mililitro de medio MEM. Cuente las células con un hemocitómetro y colóquelas a 800,000 células por cubreobjetos en 500 microlitros de medio MEM. Después de eso, colóquelos en una incubadora a 37 grados centígrados con 6% de dióxido de carbono. Luego, haga una solución de medio MEM que contenga 10 micromolares del inhibidor del ciclo celular, AraC.

Para cada cubreobjetos, retenga 250 microlitros del medio viejo en una placa nueva de 24 pocillos y aspire el resto. Agregue 250 microlitros de medio MEM normal para lavar las celdas. Posteriormente, agregue 250 microlitros de medio viejo a las celdas y rellénelo con 250 microlitros de medio que contenga AraC.

En este procedimiento, agregue LME puro a cinco mililitros de medio MEM para obtener una concentración final de 150 milimolar LME. Regrese la solución a pH 7.4 usando una solución ácido-base. Luego, fíltrelo estéril con un PES de 28 milímetros con filtro de jeringa de 0,2 micrómetros.

A continuación, diluya la solución de LME a una concentración de 50 milimolares en medio MEM. Luego, colóquelo en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 10 minutos, junto con un medio MEM normal para cultivos de control. Después de 10 minutos, retire 250 microlitros del medio MEM de cada cultivo de CGC. Luego, retenga el medio a 37 grados centígrados.

A continuación, trate las células con medio MEM que contenga dos veces LME o con medio MEM precalentado sin LME para cultivos de control. Incube las células a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada con 6% de dióxido de carbono durante una hora. Luego, lave las células dos veces en medio MEM fresco precalentado para eliminar el medio que contiene LME.

Luego, reemplace el medio de cultivo retenido con una cantidad igual de medio MEM fresco precalentado. Por último, incube los cultivos en dióxido de carbono humidificado al 6% a 37 grados centígrados.