Establecimiento de un cultivo tridimensional de células gliales derivadas del cerebro de rata

Tome una microplaca con un cultivo adherente de células gliales derivadas de un cerebro de rata. El cultivo contiene astrocitos, microglía y oligodendrocitos.

Retire el medio, incube con una solución enzimática para separar las células y luego transfiéralas a un tubo.

Centrifugar y eliminar el sobrenadante con restos celulares. Vuelva a suspender las células en un medio tibio.

Triturar con una jeringa para romper los grumos celulares y filtrar con un colador para obtener una suspensión unicelular.

Agregue un biopolímero fotoreticulable, agentes de reticulación y componentes de matriz extracelular.

Vierta la mezcla en un molde unido a un cubreobjetos. Exponga la mezcla a luz de alta intensidad para inducir la reticulación, formando un gel y encapsulando las células gliales.

Retire el molde y coloque los cubreobjetos en una microplaca. Agregue un medio tibio e incube el gel en condiciones fisiológicas.

Las células proliferan dentro de la matriz extracelular de soporte y crean una red celular, estableciendo un cultivo tridimensional de células gliales.

24 horas antes de la encapsulación celular, aspire el medio de cultivos primarios de dos semanas y agregue 1 mililitro de medio fresco a cada pocillo. El día de la encapsulación celular, prepare 12,5 mililitros de tripsina diluida y 25 mililitros de medio por cada placa de 12 pocillos, y caliente a 37 grados centígrados en un baño de agua. Luego, use una pipeta serológica de 10 mililitros para agregar alrededor de 1 mililitro de tripsina diluida a cada pocillo de la placa de 12 pocillos.

Incube durante 20 a 30 minutos a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono hasta que la capa de células confluentes se desprenda de la placa. Después de la incubación, use una pipeta de 1 mililitro para recuperar las células desprendidas, que deben aparecer como una sola pieza flotante, y transfiéralas a un tubo de centrífuga cónico de 15 mililitros. Diluir con un volumen equivalente de medio y centrifugar a 200 veces g durante 2 minutos a temperatura ambiente.

Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular en 10 mililitros de medio tibio. Triture las células cinco veces con la pipeta, luego, centrifugue nuevamente a 200 veces g durante dos minutos. Después del centrifugado, decantar el sobrenadante, volver a suspender las células en 5 mililitros de medio tibio y transferir las células a un tubo de centrífuga cónico de 50 mililitros.

Luego, usando una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 18, triture la solución celular tres veces y filtre la suspensión a través de un tamiz celular de 40 micras en un nuevo tubo de centrífuga cónico. A continuación, recolecte 10 microlitros de suspensión celular y diluya de 1 a 100 en medio tibio y cuente las células con un contador de células automatizado.

Incube las células restantes en un baño de agua a 37 grados centígrados hasta el paso de encapsulación. Caliente 12,5 mililitros de medio naif y 12,5 mililitros de medio acondicionado para cada placa de 12 pocillos de hidrogeles 3D de la planta. Luego, pesar 7 miligramos de HAMA por placa de 12 pocillos de la planta y agregar a filtrado estéril para una concentración del 2% en peso por volumen. Sonicar la solución durante 60 minutos a 20 kilohercios hasta que el HAMA se disuelva por completo.

Durante la sonicación, prepare soluciones individuales al 10% de TEA y NVP. También prepare una solución de 1 milimolar de eosina en alícuotas de 1 mililitro de PBS estéril. Luego, para cada placa de 12 pocillos, haga una mezcla final de 1.4 1.4 mililitros de 1 x 10 7 celdas, 0.5% de HAMA, 20% de mezcla de lámina basal en PBS, 0.1% de TEA, 0.1% de NVP y 0.01 milimolar de eosina Y.

Después de mezclar suavemente la solución, use una pipeta equipada con una punta de 1 mililitro para dispensar 100 microlitros en cada molde de PDMS. Luego, exponga las muestras a una luz LED verde de alta intensidad en una caja cerrada durante 5 minutos a temperatura ambiente.

La exposición de cinco minutos al LED verde es esencial para formar el gel 3D. El color rojo introducido por la eosina Y se volverá transparente e indicará la terminación de la reacción.

Luego, agregue 1 mililitro de medios acondicionados tibios a cada pocillo de una placa de 12 pocillos; sujete cada cubreobjetos entre el pulgar y el índice y use pinzas curvas para despegar lentamente el molde PDMS sin desplazar el gel. Coloca el molde en un pozo con medio acondicionado.

Eliminar el moho es el paso más desafiante. Debe hacerse con sumo cuidado para evitar que el gel se desprenda y se fracture el cubreobjetos. Esto puede requerir práctica.

Después de que todos los moldes se hayan transferido a los pocillos de la placa, agregue 1 mililitro adicional de medio DMEM / F12 tibio a cada pocillo. Incube las placas a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono durante dos semanas antes de obtener imágenes.