Aislamiento de neuronas DRG y cocultivo con precursores de células de Schwann para generar células de Schwann

Tomemos la médula espinal de un embrión de rata con ganglios de la raíz dorsal adheridos, o DRG, que contienen neuronas y células gliales.

Separe los DRG individuales del cable, transfiéralos a un tubo y centrifuge, desechando cualquier resto de tejido.

Agregue enzimas para disociar las neuronas DRG y las células gliales.

Gire las celdas y elimine cualquier residuo. Agregue un medio de mantenimiento neuronal y triture para generar una suspensión unicelular.

Transfiera la suspensión a una microplaca recubierta con un sustrato de cultivo, promoviendo la adherencia celular.

Introducir un medio de purificación e incubar. Los agentes inhibidores del medio eliminan las células gliales en división, mientras que las neuronas que no se dividen sobreviven.

Tome células similares a células de Schwann, o CPCP, en un medio de cocultivo. Los CPCP, precursores de las células de Schwann, interactúan con las neuronas nerviosas periféricas embrionarias.

Introduzca la suspensión en las neuronas DRG e incube. La interacción de los CPCP con las neuronas DRG promueve su maduración en células de Schwann.

Las células de Schwann generadas están listas para su análisis.

Para cosechar los ganglios de la raíz dorsal, transfiera el primer embrión a una placa de cultivo de 10 centímetros que contenga PBS a temperatura ambiente bajo un microscopio de disección en posición prona e inserte pinzas de microdisección a ambos lados de la médula espinal.

Usando una disección roma, separe la médula espinal del tejido blando circundante, usando fórceps para extirpar la médula espinal a lo largo de la abertura del cuello y el trozo de la cola. Extraer el tejido blando residual de la médula espinal liberada hasta que solo queden la médula espinal, las raíces nerviosas y el ganglio de la raíz dorsal adherido.

Separe los ganglios individuales de la raíz dorsal de sus raíces nerviosas conectadas. Luego, use una pipeta equipada con una punta de pipeta de 1 mililitro para transferir hasta 100 ganglios de la raíz dorsal a un tubo de microcentrífuga de PBS de 1,5 mililitros.

Recoger los ganglios por centrifugación y volver a suspender los gránulos en 200 microlitros de reactivo de disociación de células enzimáticas recombinantes por tubo. Después de 10 minutos a 37 grados centígrados, centrifugar los ganglios de la raíz dorsal nuevamente con una punta de pipeta de 200 microlitros para triturar suavemente los gránulos en el medio de mantenimiento de neuronas postganglionares de la raíz dorsal.

Siembre las células ganglionares de la raíz dorsal a 5 x 10³ células por centímetro cuadrado en placas de seis pocillos recubiertas de laminina poli-D-lisina en 1,5 mililitros de medio de mantenimiento de neuronas ganglionares de la raíz dorsal por pocillo.

Después de dos días en cultivo a 37 grados Celsius y 5% de CO₂, lave las células y devuelva los cultivos de células neuronales a la incubadora en medio fresco de purificación de neuronas ganglionares de la raíz dorsal durante otros dos días.

Después de 3 a 4 ciclos de mantenimiento y purificación, los cultivos de células ganglionares de la raíz dorsal deberían dar positivo para el marcador neuronal Tuj-1 y negativo para el marcador de células gliales S100 beta.

En el día 7 del cultivo celular similar a las células de Schwann, enjuague las células en PBS, seguido de disociación con 0,5 mililitros de reactivo de disociación de células enzimáticas recombinantes por pocillo a 37 grados Celsius durante 5 minutos. Vuelva a suspender el sedimento celular en medio de cocultivo y siembre las células similares a las células de Schwann en el cultivo de neuronas ganglionares de la raíz dorsal purificada a 1 x 10³ células por centímetro cuadrado durante 14 días de cocultivo a 37 grados Celsius y 5% de CO₂.