Name: La huella de ADN de Mycobacterium leprae Uso de las cepas Repita Variable Tandem Número (VNTR) - Análisis de longitud de fragmentos (FLA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprende a generar huellas dactilares de ADN de Mycobacterium leprae mediante análisis de fragmentos de repetición variable en tándem (VNTR) en muestras clínicas. Esta técnica permite rastrear la transmisión de la lepra y apoyar programas de eliminación de la enfermedad.

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</ol>

La recogida de muestras de piel de pacientes con lepra requiere médicos clínicos especializados o técnicos que trabajan en las clínicas de la piel. Los trabajadores de laboratorio que manipula las muestras deben tener mucho cuidado al usar batas, guantes y protección para los ojos y trabajar en un gabinete de bioseguridad al manipular muestras de tejido humano infectado o armadillo. Desinfección de superficies y herramientas también es fundamental. Trabajar en un lugar limpio, estéril bio-seguridad del gabinete es importante para evitar la contaminación de las muestras de ADN. La extracción de ADN se ha convertido en relativamente fácil gracias al desarrollo de kits de extracción de empresas como Qiagen. Instrucciones deben ser seguidas cuidadosamente. Todas las muestras deben mantenerse en frío, cuando no esté en uso. Evitar la repetición, cambios extremos de temperatura para las muestras. Cebadores de ADN utilizado en este trabajo se pueden pedir de varias empresas que han sido citados en la lista de referencias bibliográficas al final de este documento. Se debe tener cuidado al trabajar con los primers en un ambiente libre de ADN con el fin de evitar la contaminación. Cebadores vienen en forma de polvo seco y se debe mezclar con TE y se diluye a una concentración de 100μM, se separa en cantidades más pequeñas (Figura 2a). Las soluciones de trabajo de los cebadores se vuelve a diluir a concentraciones de 10μM. Una vez más, no utilizan las muestras de ADN en las áreas / campanas que se utilizan cebos y preparados. Los productos de PCR también deben mantenerse en frío, cuando no esté en uso. Un 3% de agarosa preparación del gel le dará una mejor separación de las bandas de ADN, pero tarda más en ejecutarse. Con fines puramente cualitativa, el 2% es suficiente. Solución de bromuro de etidio utilizado para teñir el ADN en geles de agarosa es una genotoxina muy activo que se absorbe por la piel. Manejar esta solución y geles teñidos con él usando mucho cuidado y estar siempre asegúrese de usar guantes. Lávese las manos minuciosamente después de manipular el ADN de muestras o materiales de bromuro de etidio. Disponer de una solución de tinción con bromuro de etidio, lavar y geles de acuerdo con las directrices institucionales. Geles no son habitualmente requeridos, este paso puede ser eliminada una vez métodos FLA se han establecido. Es mucho tiempo y reactivos. La solución de formamida utilizados en la preparación de muestras para la FLA es también muy tóxico y debe ser manejado con cuidado. Lávese las manos después de su uso. Disponer de ella siguiendo las directrices institucionales. Lectura de los resultados de la FLA utilizando el software del escáner pico puede ser un reto. Un conjunto básico de llamadas alelos (número de repeticiones en tándem) ha sido desarrollado en CSU (Tablas 4-7). (Cabe señalar que los cuadros 7.4 no sea definitiva. Como otras cepas de M. leprae se estudian, los alelos con el número de copias fuera de los rangos mencionados pueden ser encontrados.) Uno de los retos en particular es &quot;tartamudeo&quot; picos. Estas son las familias de los picos, sobre todo de los ROS que sólo implican 2-3 repeticiones de pares de bases, tales como (TA) 10. A veces la selección de la punta correcta para leer es difícil (Figura 7). En esta figura, el pico en el control positivo de 190 pb es el pico principal. Picos más bajos de altura, que son 2, 4, o incluso 6 pares de bases de mayor o menor que el pico principal se denominan &quot;picos de tartamudear. A-cola también puede causar confusión. A-cola se ha descrito anteriormente en el texto y en la Figura 8. Por último, si los productos de PCR son muy abundantes en las muestras, los picos pueden aparecer con un aumento doble. En este caso, lea el centro de la forma de pico. (Ver Figura 6, los pacientes 6.) Gestión de datos puede ser una tarea formidable para este tipo de trabajo. Es importante registrar toda la información pertinente para todos los experimentos, tales como: fecha de una tarea o procedimiento, el operador tira / la placa de los mapas, las órdenes de FLA, las condiciones de PCR y las recetas, las fechas de los geles y las fotografías, las temperaturas de almacenamiento, las diluciones de ADN de la plantilla, FLA lugares de almacenamiento de archivos electrónicos, etc organización y una gestión de datos puede ahorrar horas de tiempo dedicado a buscar información específica en el futuro. El trabajo de laboratorio se describe aquí ha estado ocurriendo desde hace varios años en la Universidad Estatal de Colorado y en otros lugares alrededor del mundo. La imagen grande de lo que todos los datos recogidos medios y la forma en que pueden ser de uso en el futuro está empezando a surgir. Figuras 10A y 10B muestran cómo estas huellas de ADN se pueden utilizar para distinguir diferentes M. leprae entre los países (10A) o incluso entre las familias (10B). Casos de la familia y la comunidad vinculada Se ha demostrado que para llevar a M. leprae de tipos de cepas similares o idénticos VNTR. La esperanza es que tal vez sea posible para obtener una mayor comprensión del modo (s) de transmisión de la lepra, para que un sistema de detección precoz de las redes de transmisión puede ser desarrollado para los meses la gentet en situación de riesgo, y que el tratamiento farmacológico curativo puede comenzar antes de daño neurológico permanente y dermatológicos que se hace.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Sangre y DNeasy Tissue Kit </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td><td></td></tr><tr><td> Multiplex PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 206143 </td><td></td></tr><tr><td> Cartilla de ADN </td><td> Varios </td><td></td><td></td></tr><tr><td> En gel de agarosa </td><td> Varios </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel de 5x o 6x tampón de carga </td><td> New England Biolabs </td><td> B7021S </td><td> Recetas disponibles para hacer su propia * </td></tr><tr><td> Solución de bromuro de etidio </td><td> Varios </td><td></td><td> Diluir en contra. </td></tr><tr><td> Hi-Di formamida Solución </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311320 </td><td></td></tr><tr><td> Gene exploración -500 LIZ </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4322682 </td><td></td></tr></tbody></table> <a href="http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html">* Http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html</a> <table border="1"><tbody><tr><th> Equipo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> 2 refrigeradores </td><td> 4 ° C: 1 para las muestras de ADN, uno de los cebadores y reactivos Multiplex </td></tr><tr><td> Un horno de microondas </td><td> O la manera adecuada para la calefacción de agarosa y agua para hacer geles </td></tr><tr><td> Un autoclave </td><td> O de olla a presión para la esterilización de los materiales </td></tr><tr><td> PCR máquina </td><td> Termociclador </td></tr><tr><td> 2 juegos de pipetas </td><td> 0,5-10 l, l 10-100, 20-200 l, 1000 l 1 juego de primers, 1 juego de ADN </td></tr><tr><td> Gel de electroforesis submarina caja </td><td> Con las formas y peines para la preparación de los geles. </td></tr><tr><td> Electroforesis de la fuente de alimentación </td><td> Con cables para la conexión a la caja de gel </td></tr><tr><td> Bloque de calor </td><td> Para tubos Eppendorf </td></tr><tr><td> Centrífugo </td><td> Para los tubos Eppendorf / tiras </td></tr><tr><td> Sistema de electroforesis capilar (analizador genético) </td><td> O el acceso a una institución que puede realizar este análisis </td></tr><tr><td> Plásticos </td><td> Aerosol desechables puntas de pipeta, tubos Eppendorf, tiras de 8 pocillos, placas de 96 pozos, algunos de calidad óptica </td></tr><tr><td> Ordenador con conexión a Internet </td><td></td></tr></tbody></table>

la huella de adn de mycobacterium leprae uso de las cepas repita variable tandem número (vntr) - análisis de longitud de fragmentos (fla)

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

El estudio de la transmisión de la lepra es particularmente difícil, ya que el agente causal, Mycobacterium leprae, no se pueden cultivar en el laboratorio. Las únicas fuentes de las bacterias son los enfermos de lepra, y armadillos infectados experimentalmente y los ratones desnudos. Así, muchos de los métodos utilizados en la epidemiología moderna no están disponibles para el estudio de la lepra. A pesar de un extenso programa global de tratamiento de drogas para la lepra implementado por la OMS 1, la lepra sigue siendo endémica en muchos países, con aproximadamente 250.000 nuevos casos cada año. 2 Toda la M. leprae genoma ha sido mapeado 3,4 y muchos loci han sido identificados que han repetido los segmentos de dos o más pares de bases (llamados micro y minisatélites). 5 cepas clínicas de M. leprae puede variar en el número de segmentos repetidos en tándem (repeticiones cortas en tándem, STR) en muchos de estos lugares. 5,6,7 repetir tándem número variable (VNTR) 5 de análisis se ha utilizado para distinguir las diferentes cepas del bacilo de la lepra. Algunos de los lugares parecen ser más estables que otros, que muestran una menor variación en el número de repeticiones, mientras que otros parecen cambiar más rápidamente, a veces en el mismo paciente. Mientras que la variabilidad de ciertas VNTRs ha planteado preguntas acerca de su idoneidad para la tipificación de cepas 7,8,9, los datos emergentes sugieren que el análisis de múltiples loci, que son diversos en su estabilidad, se puede utilizar como una herramienta epidemiológica útil. Múltiples locus VNTR análisis (MLVA) 10 se ha utilizado para estudiar la evolución de la lepra y la transmisión en varios países incluyendo a China 11,12, 8 Malawi, Filipinas 10,13, y Brasil 14. MLVA implica varios pasos. En primer lugar, el ADN bacteriano se extrae junto con el ADN del huésped de tejido de biopsias clínicas o manchas raja la piel (SSS). El 10 loci deseados se amplifican a partir del ADN extraído a través de la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Cebadores fluorescente marcada por 4-5 diferentes loci se utilizan por reacción, con 18 loci que se amplifica en un total de cuatro reacciones. 10 Los productos de PCR puede ser sometido a electroforesis en gel de agarosa para verificar la presencia de los segmentos de ADN deseada, y luego presentado para el análisis de fluorescencia de longitud de fragmentos (FLA) mediante electroforesis capilar. ADN de las bacterias armadillo pasajes con un número conocido de copias de repetición para cada locus se utiliza como control positivo. Los cromatogramas FLA son examinados usando el software del escáner de pico y la longitud del fragmento se convierte en el número de copias VNTR (alelo). Finalmente, los haplotipos VNTR se analizan los patrones, y cuando se combina con los datos clínicos del paciente puede ser usado para rastrear la distribución de los tipos de cepa.

La lepra, causada por<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt;, Sigue siendo endémica en muchos lugares. Con el fin de aprender acerca de la propagación y el modo de transmisión de la lepra, es importante determinar qué cepa del<em&gt; M. leprae</em&gt; Ha infectado a un paciente. Un número variable de repeticiones en tándem (VNTR) escribir es uno de esos métodos.

La huella de ADN de Mycobacterium leprae Uso de las cepas Repita Variable Tandem Número (VNTR) - Análisis de longitud de fragmentos (FLA)

El estudio de la transmisión de la lepra es particularmente difícil dado que el agente causal, Mycobacterium leprae, no puede cultivarse en el laboratorio.

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar una huella genética distintiva de Mycobacterium leprae, la bacteria no cultivable que causa la lepra, directamente a partir de especímenes clínicos. El ADN bacteriano de M. leprae, extraído de biopsias de pacientes, se amplifica mediante una PCR múltiple utilizando cebadores fluorescentes específicos para los loci de repeticiones en tándem de número variable o VNTR. Una vez que el ADN ha sido amplificado, se realiza electroforesis capilar para el análisis de la longitud de los fragmentos. Los datos se analizan para determinar el número de segmentos de ADN con repeticiones tandem cortas en cada locus. Debido a que diferentes cepas de EPRI presentan distintos números de repeticiones tandem en cada locus. Los datos de múltiples loci producen huellas genéticas únicas y se puede generar una base de datos de los tipos de cepas de los pacientes utilizando esta técnica.La estructura poblacional, la evolución y la transmisión de la lepra entre pacientes en comunidades definidas y a nivel mundial pueden caracterizarse, proporcionando finalmente herramientas genéticas y evidencia para la eliminación de la lepra. Este método puede utilizarse para rastrear la propagación de la lepra, identificar grupos de infecciones recientes y personas en riesgo, y medir la eficacia de programas controlados. Demostrarán el procedimiento Lee y Ron Jensen, investigadores de mi laboratorio, y Jason Rivers del servicio central de instrumentación. Extraiga el ADN de biopsias clínicas utilizando un kit estándar de extracción de ADN KaiGen.Una vez obtenido el ADN, prepare un área de trabajo nueva dentro de un gabinete PCR limpio. Para evitar cualquier contaminación de ADN, limpie el gabinete y un juego de pipetas con etanol al 70 % y exponga el gabinete y las pipetas a luz UV durante 15 minutos. Una vez que el gabinete esté limpio, puede prepararse la PCR múltiple; para cada reacción de PCR múltiple, utilice cuatro o cinco pares de cebadores, en los que uno de los cebadores de cada par esté marcado con un fluoróforo.Debe mezclarse. Utilice reservas de cebadores de 10 micromolar preparadas en tampón TE para hacer las mezclas de cebadores; mezcle cantidades iguales de todos los cebadores directos o superiores en un tubo Eppendorf para obtener una concentración final de dos micromolar. Para cada cebador, agregue tampón TE si es necesario.En otro tubo, mezcle todos los cebadores inversos o cebadores inferiores de la misma manera. Una vez preparadas las mezclas de cebadores, prepare la mezcla PCR MES. Elabore un mapa de placa etiquetado con todas las muestras y controles por muestra.La mezcla maestra debe contener 12 microlitros de la mezcla de PCR múltiple KaiGen, dos microlitros de cada grupo de cebadores y dos microlitros de solución Q. Asegúrese de preparar suficiente mezcla maestra para incluir los controles y tener en cuenta las pérdidas por pipeteo. Centrifugue brevemente la mezcla maestra.A continuación, alícuota 18 microlitros de la mezcla maestra en cada pocillo de una placa de PCR. Para evitar la contaminación de las muestras de ADN, cámbiese los guantes, limpie y desinfecte una cabina de seguridad biológica separada. Como antes, una vez que la cabina haya sido descontaminada, transfiera la placa a esa cabina.Luego, agregue dos microlitros de la muestra de ADN a cada pocillo que contenga la mezcla maestra. Asegúrese de usar puntas de pipeta con prevención de aerosoles para evitar la contaminación cruzada. Selle cuidadosamente las placas de PCR y centrifugue brevemente para mezclar el contenido.Luego, coloque la placa de reacción en el termociclador e inicie el programa de PCR para la presentación de muestras. Para FLA, prepare el tamaño del formamida, la mezcla maestra y agregue los productos de PCR diluidos en un tubo einor limpio combinando 12 microlitros de solución de formamida altamente pura y 0,3 microlitros del patrón de tamaño Gene Scan 500 por muestra a analizar. Aliquote 12,3 microlitros de esta solución por pocillo en una placa de reacción óptica de 96 pocillos.Una vez finalizada la PCR, se centrifuga la placa. Asegúrese de que la posición de cada muestra se registre en el mapa de la placa. Luego, en una placa de 96 pocillos separada, reparta 59 microlitros de agua libre de nucleasas por pocillo y agregue un microlitro de cada reacción de PCR por pocillo para diluir el ADN amplificado en una proporción de 1 a 60.Una vez que el ADN se haya diluido, utilice una pipeta multicanal para transferir un microlitro de cada muestra de PCR diluida al pocillo correspondiente de la placa que contiene la solución libre de formamida. Una vez finalizado el programa, las muestras pueden analizarse mediante electroforesis estándar en gel de agarosa para confirmar que en este punto se han amplificado fragmentos de ADN de los tamaños predichos. Las muestras se preparan para el análisis mediante electroforesis capilar fluorescente utilizando un analizador genético FLA; antes del análisis, agregue un septo a la placa y centrifugue brevemente para eliminar burbujas de aire y hacer que la muestra descienda al fondo del pocillo.El IDE desnaturalizará químicamente las cadenas, por lo que no es necesario desnaturalizar mediante calor. Coloque la placa en una bandeja de carga. Evalúe el producto de PCR marcado mediante electroforesis capilar, como el analizador genético ABBI'S 31 30 xl.Analice las muestras utilizando un capilar de 50 centímetros relleno con polímero POP-7 como medio de separación. El ADN migra hacia el extremo del capilar, donde un láser y un detector miden las etiquetas fluorescentes; abra el software de recolección del analizador. Será necesario calibrar el analizador para detectar todos los colorantes utilizados antes de correr las muestras, incluyendo el estándar de tamaño; el conjunto de datos utilizado para estas muestras es el G5 de ABIs. Las muestras se inyectan electrocinéticamente a 1,6 kilovoltios durante 15 segundos.Separar los fragmentos aplicando 15 kilovoltios durante 1800 segundos. El tiempo total de ejecución de cada corrida es de aproximadamente 45 minutos. Una vez finalizada la corrida, crear archivos de datos para cada muestra.Los archivos se colocan en una carpeta de placa mediante el software de recolección del analizador en una ubicación predeterminada. Los archivos están en formato FSA. Los datos de FLA pueden analizarse utilizando software de escaneo de picos, disponible gratuitamente en el sitio web de Applied Biosystems.Para analizar los datos, haga clic en comenzar un nuevo proyecto, seguido de agregar archivos. Cargue los archivos de datos seleccionados en el programa, incluyendo los controles positivos y negativos. Seleccione y analice los archivos cargados.Los resultados se representan como un cromatograma FLA. Los patrones de tamaño aparecen como picos naranjas, mientras que los picos coloreados representan las muestras de ADN bacteriano para cada locus analizado en la muestra; haga clic en un pico para determinar su tamaño en pares de bases. Debido a la síntesis por deslizamiento de la cadena por la ADN polimerasa, se detectará una familia de picos del mismo color para algunos locus de microsatélites.En estos casos, el pico seleccionado generalmente es el de mayor amplitud. Compare los tamaños de los fragmentos en cada muestra con el tamaño del control positivo para determinar cuántos segmentos de repeticiones en tándem están presentes para cada alelo analizado y registre los datos en una hoja de cálculo de Excel para su posterior análisis. En esta figura, se muestran las huellas de ADN de aislamientos de siete pacientes pertenecientes a tres familias diferentes de la misma aldea, y se indica el número de repeticiones en tándem para cada locus polimórfico analizado.Estos datos sugieren que dos miembros de la familia be están infectados con la misma cepa, mientras que un miembro está infectado con una cepa distinta. Es probable que los miembros de las familias C estén infectados con la misma cepa. Lo mismo ocurre con los miembros de la familia A. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo incluir rutinariamente la PCR múltiple y el análisis de longitud de fragmentos para obtener perfiles de ADN-V-N-T-R para pacientes con lepra que acuden a las clínicas.Estas son herramientas moleculares novedosas que complementan la epidemiología convencional para el control de la enfermedad de la lepra.

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La huella de ADN de Mycobacterium leprae Uso de las cepas Repita Variable Tandem Número (VNTR) - Análisis de longitud de fragmentos (FLA) (Video) | JoVE Journal

La huella de ADN de Mycobacterium leprae Uso de las cepas Repita Variable Tandem Número (VNTR) - Análisis de longitud de fragmentos (FLA)

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