La huella de ADN de Mycobacterium leprae Uso de las cepas Repita Variable Tandem Número (VNTR) - Análisis de longitud de fragmentos (FLA)

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar una huella genética distintiva de Mycobacterium leprae, la bacteria no cultivable que causa la lepra, directamente a partir de especímenes clínicos. El ADN bacteriano de M. leprae, extraído de biopsias de pacientes, se amplifica mediante una PCR múltiple utilizando cebadores fluorescentes específicos para los loci de repeticiones en tándem de número variable o VNTR. Una vez que el ADN ha sido amplificado, se realiza electroforesis capilar para el análisis de la longitud de los fragmentos.

Los datos se analizan para determinar el número de segmentos de ADN con repeticiones tandem cortas en cada locus. Debido a que diferentes cepas de EPRI presentan distintos números de repeticiones tandem en cada locus. Los datos de múltiples loci producen huellas genéticas únicas y se puede generar una base de datos de los tipos de cepas de los pacientes utilizando esta técnica.

La estructura poblacional, la evolución y la transmisión de la lepra entre pacientes en comunidades definidas y a nivel mundial pueden caracterizarse, proporcionando finalmente herramientas genéticas y evidencia para la eliminación de la lepra. Este método puede utilizarse para rastrear la propagación de la lepra, identificar grupos de infecciones recientes y personas en riesgo, y medir la eficacia de programas controlados. Demostrarán el procedimiento Lee y Ron Jensen, investigadores de mi laboratorio, y Jason Rivers del servicio central de instrumentación. Extraiga el ADN de biopsias clínicas utilizando un kit estándar de extracción de ADN KaiGen.

Una vez obtenido el ADN, prepare un área de trabajo nueva dentro de un gabinete PCR limpio. Para evitar cualquier contaminación de ADN, limpie el gabinete y un juego de pipetas con etanol al 70 % y exponga el gabinete y las pipetas a luz UV durante 15 minutos. Una vez que el gabinete esté limpio, puede prepararse la PCR múltiple; para cada reacción de PCR múltiple, utilice cuatro o cinco pares de cebadores, en los que uno de los cebadores de cada par esté marcado con un fluoróforo.

Debe mezclarse. Utilice reservas de cebadores de 10 micromolar preparadas en tampón TE para hacer las mezclas de cebadores; mezcle cantidades iguales de todos los cebadores directos o superiores en un tubo Eppendorf para obtener una concentración final de dos micromolar. Para cada cebador, agregue tampón TE si es necesario.

En otro tubo, mezcle todos los cebadores inversos o cebadores inferiores de la misma manera. Una vez preparadas las mezclas de cebadores, prepare la mezcla PCR MES. Elabore un mapa de placa etiquetado con todas las muestras y controles por muestra.

La mezcla maestra debe contener 12 microlitros de la mezcla de PCR múltiple KaiGen, dos microlitros de cada grupo de cebadores y dos microlitros de solución Q. Asegúrese de preparar suficiente mezcla maestra para incluir los controles y tener en cuenta las pérdidas por pipeteo. Centrifugue brevemente la mezcla maestra.

A continuación, alícuota 18 microlitros de la mezcla maestra en cada pocillo de una placa de PCR. Para evitar la contaminación de las muestras de ADN, cámbiese los guantes, limpie y desinfecte una cabina de seguridad biológica separada. Como antes, una vez que la cabina haya sido descontaminada, transfiera la placa a esa cabina.

Luego, agregue dos microlitros de la muestra de ADN a cada pocillo que contenga la mezcla maestra. Asegúrese de usar puntas de pipeta con prevención de aerosoles para evitar la contaminación cruzada. Selle cuidadosamente las placas de PCR y centrifugue brevemente para mezclar el contenido.

Luego, coloque la placa de reacción en el termociclador e inicie el programa de PCR para la presentación de muestras. Para FLA, prepare el tamaño del formamida, la mezcla maestra y agregue los productos de PCR diluidos en un tubo einor limpio combinando 12 microlitros de solución de formamida altamente pura y 0,3 microlitros del patrón de tamaño Gene Scan 500 por muestra a analizar. Aliquote 12,3 microlitros de esta solución por pocillo en una placa de reacción óptica de 96 pocillos.

Una vez finalizada la PCR, se centrifuga la placa. Asegúrese de que la posición de cada muestra se registre en el mapa de la placa. Luego, en una placa de 96 pocillos separada, reparta 59 microlitros de agua libre de nucleasas por pocillo y agregue un microlitro de cada reacción de PCR por pocillo para diluir el ADN amplificado en una proporción de 1 a 60.

Una vez que el ADN se haya diluido, utilice una pipeta multicanal para transferir un microlitro de cada muestra de PCR diluida al pocillo correspondiente de la placa que contiene la solución libre de formamida. Una vez finalizado el programa, las muestras pueden analizarse mediante electroforesis estándar en gel de agarosa para confirmar que en este punto se han amplificado fragmentos de ADN de los tamaños predichos. Las muestras se preparan para el análisis mediante electroforesis capilar fluorescente utilizando un analizador genético FLA; antes del análisis, agregue un septo a la placa y centrifugue brevemente para eliminar burbujas de aire y hacer que la muestra descienda al fondo del pocillo.

El IDE desnaturalizará químicamente las cadenas, por lo que no es necesario desnaturalizar mediante calor. Coloque la placa en una bandeja de carga. Evalúe el producto de PCR marcado mediante electroforesis capilar, como el analizador genético ABBI'S 31 30 xl.

Analice las muestras utilizando un capilar de 50 centímetros relleno con polímero POP-7 como medio de separación. El ADN migra hacia el extremo del capilar, donde un láser y un detector miden las etiquetas fluorescentes; abra el software de recolección del analizador. Será necesario calibrar el analizador para detectar todos los colorantes utilizados antes de correr las muestras, incluyendo el estándar de tamaño; el conjunto de datos utilizado para estas muestras es el G5 de ABIs. Las muestras se inyectan electrocinéticamente a 1,6 kilovoltios durante 15 segundos.

Separar los fragmentos aplicando 15 kilovoltios durante 1800 segundos. El tiempo total de ejecución de cada corrida es de aproximadamente 45 minutos. Una vez finalizada la corrida, crear archivos de datos para cada muestra.

Los archivos se colocan en una carpeta de placa mediante el software de recolección del analizador en una ubicación predeterminada. Los archivos están en formato FSA. Los datos de FLA pueden analizarse utilizando software de escaneo de picos, disponible gratuitamente en el sitio web de Applied Biosystems.

Para analizar los datos, haga clic en comenzar un nuevo proyecto, seguido de agregar archivos. Cargue los archivos de datos seleccionados en el programa, incluyendo los controles positivos y negativos. Seleccione y analice los archivos cargados.

Los resultados se representan como un cromatograma FLA. Los patrones de tamaño aparecen como picos naranjas, mientras que los picos coloreados representan las muestras de ADN bacteriano para cada locus analizado en la muestra; haga clic en un pico para determinar su tamaño en pares de bases. Debido a la síntesis por deslizamiento de la cadena por la ADN polimerasa, se detectará una familia de picos del mismo color para algunos locus de microsatélites.

En estos casos, el pico seleccionado generalmente es el de mayor amplitud. Compare los tamaños de los fragmentos en cada muestra con el tamaño del control positivo para determinar cuántos segmentos de repeticiones en tándem están presentes para cada alelo analizado y registre los datos en una hoja de cálculo de Excel para su posterior análisis. En esta figura, se muestran las huellas de ADN de aislamientos de siete pacientes pertenecientes a tres familias diferentes de la misma aldea, y se indica el número de repeticiones en tándem para cada locus polimórfico analizado.

Estos datos sugieren que dos miembros de la familia be están infectados con la misma cepa, mientras que un miembro está infectado con una cepa distinta. Es probable que los miembros de las familias C estén infectados con la misma cepa. Lo mismo ocurre con los miembros de la familia A. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo incluir rutinariamente la PCR múltiple y el análisis de longitud de fragmentos para obtener perfiles de ADN-V-N-T-R para pacientes con lepra que acuden a las clínicas.

Estas son herramientas moleculares novedosas que complementan la epidemiología convencional para el control de la enfermedad de la lepra.