Replaticado de neuronas diferenciadas derivadas de células madre pluripotentes humanas

Comience con una placa de cultivo grande que contenga neuronas diferenciadas derivadas de células madre pluripotentes humanas con una red neuronal densa.

Incube estas neuronas con enzimas proteolíticas suaves para separarlas de la placa, levantándolas como una hoja.

Con la incubación continua, las enzimas interrumpen parcialmente las conexiones celulares, aflojando las redes neuronales.

Agregue un medio de cultivo para detener la actividad enzimática.

Pipetea repetidamente las neuronas separadas para separarlas entre sí.

Filtre las neuronas a través de un filtro celular para eliminar los grupos celulares y recolectar las neuronas individuales.

Centrifugar y eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspenderlos en un medio de crecimiento.

Para volver a colocar, siembre estas neuronas en un polímero y una placa de múltiples pocillos recubierta de proteína de adhesión. Incubar para permitir su unión.

Las neuronas utilizan nutrientes del medio para seguir siendo viables. Reemplace el medio de cultivo regularmente para mantener los niveles de nutrientes.

Incubar más para permitir la maduración neuronal y la formación de conexiones entre ellas.

Comience enjuagando suavemente la placa de neuronas diferenciadas con PBS. Disperse el PBS por la pared de la placa y no directamente sobre las células para evitar interrumpirlas. Aspire el PBS desde el borde del plato mientras lo inclina, teniendo cuidado de no tocar las células.

Aplique al menos 1 mililitro de enzima proteolítica por placa de 10 centímetros y devuelva las células a la incubadora durante 40 a 45 minutos. Durante la incubación, verifique las neuronas en un microscopio de contraste de fase y continúe el tratamiento con proteasa hasta que la red neuronal se separe por completo de la placa y comience a romperse. Cuando las neuronas se hayan desprendido, detenga la digestión agregando 5 mililitros de medios DMEM frescos por cada 1 mililitro de proteasa.

Utilice una pipeta serológica para triturar suavemente las células contra la placa de 5 a 8 veces, asegurándose de no aplicar demasiada presión. Cuele las células a través de una malla de 100 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros gota a gota y enjuague el colador con 5 mililitros adicionales de medio DMEM fresco.

Use una centrífuga de sobremesa para hacer girar las células a 1,000 veces g durante 5 minutos. Después de la centrifugación, regrese el tubo cónico al gabinete de bioseguridad y aspire la mayor parte del medio, dejando 250 microlitros para mantener las células húmedas. Vuelva a suspender suavemente las células en 2 mililitros de medio DMEM fresco y páselas por el extremo de una pipeta serológica de 5 mililitros.

Finalmente, invierta el tubo de 2 a tres veces. Use un hemocitómetro y azul de tripano para contar las células viables y luego diluya las células con DMEM fresco a la concentración deseada. Agregue los suplementos apropiados al tubo según los requisitos de la línea celular específica y mezcle suavemente las células inclinando el tubo cónico de 2 a 3 veces.

Aspire el recubrimiento de laminina de una placa de 24 pocillos y enjuáguelo una vez con PBS. Aspire el PBS y aplique la solución celular a cada pocillo con un movimiento en forma de ocho para evitar la formación de grumos. Cuando termine de enchapar las celdas, devuelva la placa a la incubadora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.