Desarrollo de organoides nerviosos motores derivados de iPSC humanos utilizando un chip microfluídico

Tome células madre pluripotentes inducidas humanas, o iPSC, en un medio de células madre rico en nutrientes con inhibidores de la Rho-quinasa.

Los inhibidores ingresan a las células y bloquean las enzimas Rho-quinasa, evitando la muerte celular apoptótica.

Las células utilizan los nutrientes para proliferar y agregarse espontáneamente para formar un grupo celular tridimensional llamado esferoide.

Gradualmente, reemplace el medio con un medio de inducción neuronal. Los moduladores de señalización del medio impulsan la diferenciación de las células madre en células neurales.

Reemplácelo con un medio neuronal rico en factores de crecimiento para diferenciar las células esferoides en neuronas motoras y formar un esferoide de neurona motora o MNS.

Transfiera estos MNS a un chip microfluídico recubierto de polímero que contenga un medio de maduración.

Los factores de crecimiento nervioso en el medio estimulan los axones o proyecciones más largas de las neuronas para que crezcan desde el esferoide y se extiendan a través del microcanal del chip.

Esto forma un organoide nervioso motor, un modelo tridimensional del tejido nervioso motor.

Para inducir la diferenciación celular 3D iPS en neuronas motoras, siembre 4 x 10 4 células iPS por pocillo en el número apropiado de pocillos de una placa inferior en U de 96 pocillos en 100 microlitros de alimentador y medio de cultivo celular sin suero suplementado con 10 micromolares Y27632.

Al día siguiente, reemplace el sobrenadante en cada pocillo con 100 microlitros de medio KSR suplementado con 10 micromolares SB-431542 y 100 nanomolares LDN-193189. En los días 2 y 3, reemplace los sobrenadantes con 100 microlitros de medio KSR suplementado con 10 micromolares SB-431542, 100 nanomolares LDN-193189, 5 micromolares DAPT, 5 micromolares SU-5402, 1 micromolar de ácido retinoico y un agonista micromolar suavizado. En los días 4 y 5, reemplace los sobrenadantes con una mezcla de 75% de medio KSR y 25% de medio N2, suplementado con 10 micromolares SP-431542, 100 nanomolares LDN-193189, 5 micromolares DAPT, 5 micromolares SU-5402, 1 micromolar de ácido retinoico y 1 micromolar agonista suavizado.

En los días 6 y 7, reemplace los sobrenadantes con una mezcla de 50% de medio KSR y 50% de medio N2, suplementado con 5 micromolares de DAPT, 5 micromolares de SU-5402, 1 micromolar de ácido retinoico y 1 agonista micromolar suavizado. En los días 8 y 9, reemplace los sobrenadantes con una mezcla de 25% de medio KSR y 75% de medio N2, suplementado con 5 micromolares DAPT, 5 micromolares SU-5402, 1 micromolar de ácido retinoico y 1 agonista micromolar alisado. En los días 10 y 11, reemplace los sobrenadantes con medio N2 suplementado con 5 micromolares DAPT, 5 micromolares SU-5402, 1 micromolar de ácido retinoico y 1 agonista micromolar alisado. El día 12, reemplace los sobrenadantes en cada pocillo con 100 microlitros de medio de maduración, complementados con 20 nanogramos por mililitro de factor neurotrófico derivado del cerebro por pocillo.

Para inducir la formación de organoides nerviosos motores, reemplace la solución de recubrimiento en el chip PDMS con 150 microlitros de medio de maduración complementado con 20 nanogramos por mililitro de factor neurotrófico derivado del cerebro, y use una punta de micropipeta de gran calibre para agregar suavemente esferoides de neuronas motoras de un pocillo de la placa de 96 pocillos a la entrada del microcanal del chip. Coloque un pequeño depósito de agua estéril cerca del chip de cultivo de tejidos en la placa para evitar la evaporación del medio, y coloque la placa en una incubadora de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

Cada dos o tres días, reemplace la mitad del medio de cultivo agotado del centro del depósito del medio con medio de maduración fresco suplementado con 20 nanogramos por mililitro de factor neurotrófico derivado del cerebro. Los axones crecerán desde el esferoide de la neurona motora hacia el canal, ensamblándose espontáneamente en un solo haz durante un período de dos a tres semanas para formar un organoide nervioso motor.