Reprogramación directa de células progenitoras hematopoyéticas en células madre neurales

Comience con una suspensión celular de células progenitoras hematopoyéticas genéticamente alteradas.

Estas células expresan factores de transcripción necesarios para su reprogramación en células madre neurales. Este proceso se denomina reprogramación directa.

Transfiera las células a una placa multipocillo recubierta de matriz extracelular con un medio progenitor neural e incube.

La matriz extracelular proporciona un andamio tridimensional para la unión y el crecimiento celular.

Durante la incubación, los factores de transcripción expresados por la célula progenitora hematopoyética inician una secuencia de eventos moleculares que permiten su transformación en una célula madre neural.

El medio progenitor neural contiene factores que favorecen la supervivencia de las células madre neurales inducidas.

Después de la incubación, reemplace este medio con un medio progenitor neural nuevo para promover la multiplicación celular.

Desconecte las celdas con un raspador de células.

Recoja esta suspensión y transfiera las células a un medio de células madre neurales que contenga pozos.

Incubar para el mantenimiento de células madre neurales inducidas.

Cuando las células sean de 30 a 50% de confluentes, aspire el sobrenadante y reserve, y luego agregue 1 mililitro de medio progenitor neural a cada pocillo. Para hacer una placa de respaldo usando las esferas en el sobrenadante, centrifugar el sobrenadante de reserva a 170 veces g durante 10 minutos.

Luego, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en medio progenitor neural. Placa en una placa de 24 pocillos recubierta de matrigel; Cambie el medio en cada placa de células cada dos días hasta que las células alcancen una confluencia del 60% al 80%, generalmente después de una semana.

Una vez que las células alcancen la confluencia requerida, aspire el sobrenadante y agregue 1 mililitro de medio de células madre neurales a cada pocillo. Luego, disocie las células usando un raspador celular seguido de un pipeteo muy suave.

A continuación, transfiera las células de un pocillo de la placa de 24 pocillos a un pocillo de una placa de 6 pocillos. Agregue otro mililitro de medio al pocillo y, después de repetir el procedimiento para todos los pocillos, coloque la placa de 6 pocillos en la incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius.

Cambie el volumen completo del medio cada dos días hasta que las células alcancen el 60% de confluencia. Después de cada vez, disocie y vuelva a colocar las células en una proporción de 1 a 3 como se acaba de mostrar.