Aislamiento de colonias de células progenitoras neurales inducidas derivadas de fibroblastos humanos adultos

Comience con un cultivo adherente de colonias de células progenitoras neurales inducidas derivadas de fibroblastos humanos adultos en una placa de pocillos múltiples recubierta de laminina.

Lave las colonias con un tampón para eliminar las células no adherentes, luego agregue un tampón nuevo.

Raspe alrededor de las colonias individuales para eliminar las células circundantes.

Transfiera las colonias a pocillos frescos recubiertos de laminina que contengan medio de neuroinducción.

Desagregar mecánicamente las colonias para obtener una suspensión unicelular.

La laminina, una proteína de la matriz extracelular, interactúa con las proteínas de superficie de los progenitores, facilitando la adhesión celular a la superficie del pozo.

Agregue un inhibidor de molécula pequeña que ingrese a las células y bloquee proteínas quinasas específicas, previniendo la apoptosis celular.

Los factores de crecimiento y las moléculas pequeñas presentes en el medio de neuroinducción facilitan la proliferación de los progenitores.

Reemplace periódicamente el medio para reponer los nutrientes, lo que facilita la proliferación continua de progenitores.

Un cultivo confluente, o una capa celular completamente cubierta, indica la expansión exitosa de las células progenitoras neurales inducidas.

Un día después, aspire la laminina de las placas y agregue 200 microlitros de medio de inducción neural a los pocillos. Lave las placas de seis pocillos que contienen las colonias que se van a recoger, una vez con DPBS, antes de agregar 2 mililitros de medio de inducción neural por pocillo de una placa de seis pocillos.

Recoge mecánicamente las células raspando alrededor de las colonias con una aguja delgada para deshacerte de las células circundantes y recogiendo las colonias con puntas de pipeta montadas en una pipeta de 200 microlitros colocada en 50 microlitros.

Transfiera cada colonia a un pocillo de una placa de 48 pocillos recubierta de laminina y genere una suspensión unicelular mecánicamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Agregue inhibidor de Rho-quinasa en una concentración final de 10 micromolares a las células. Haga crecer las células en la placa de 48 pocillos a 37 grados Celsius, 5% de CO₂ durante dos días. Cambie el medio cada dos días hasta que las células alcancen entre un 80% y un 90% de confluencia.