Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 3:03 min. • July 8th, 2025
Comience con dos placas de pocillos múltiples: una con un fondo grabado recubierto con un polímero y la otra con un cubreobjetos recubierto de polímero.
Siembre una suspensión de alta densidad de las neuronas embrionarias en la placa con el fondo grabado. Agregue una suspensión de neuronas de densidad ultrabaja al pozo de contención de cubreobjetos.
Incubar para permitir la unión neuronal a los polímeros.
Retire el cubreobjetos y colóquelo sobre el cultivo de neuronas de alta densidad, permitiendo que las neuronas se enfrenten entre sí.
La superficie grabada con estructuras elevadas crea un microespacio que separa neuronas de diferentes densidades.
El cultivo de alta densidad actúa como una capa alimentadora y secreta el factor de crecimiento neuronal.
Debido al espacio de difusión confinado, los factores de crecimiento se acumulan alrededor de las neuronas, facilitando su crecimiento y el desarrollo de proyecciones neuronales.
Introducir un medio neurobasal con arabinósido de citosina que inhibe selectivamente el crecimiento de las células no neuronales.
Reponer regularmente con un medio neurobasal fresco para mantener el cultivo neuronal.
En este procedimiento, coloque placas de 24 pocillos con fondos grabados para neuronas de alta densidad en la campana de cultivo. Retirar 300 microlitros del medio preacondicionado por vacío. Luego, coloque 0,6 mililitros de suspensión celular de alta densidad a 250.000 neuronas por mililitro.
Coloque las otras placas de 224 pocillos con cubreobjetos en la campana de cultivo. Retire 300 microlitros del medio preacondicionado al vacío, antes de colocar 0,6 mililitros de suspensión celular de baja densidad a 10.000 neuronas por mililitro en los cubreobjetos. Luego, devuelva todas las placas de 24 pocillos a la incubadora e incube durante dos horas. Después de eso, voltee los cubreobjetos de baja densidad con neuronas adheridas al cultivo de alta densidad y asegúrese de que las neuronas estén una frente a la otra. Posteriormente, devuelva las dos placas con cocultivo a la incubadora.
Alimente los cocultivos agregando 300 microlitros de medio de alimento fresco a DIV 5. Después de esta alimentación inicial, agregue 300 microlitros de medio de alimento fresco sin arabinósido de citosina a cada pocillo cada semana. Si el cultivo se mantiene durante más de un mes, reemplace la mitad del medio con medio de alimento fresco cada semana, más allá de un punto de tiempo de un mes.