Un método de tubo de rodillo modificado para el cultivo a largo plazo de rodajas de cerebro de roedores

Tomemos rodajas de cerebro obtenidas del cerebro de un roedor. Las rodajas consisten en el hipocampo, que contiene neuronas del hipocampo.

Transfiera las rodajas de cerebro a cubreobjetos que contengan plasma de pollo.

Aplique plasma mezclado con trombina a las rodajas. La trombina induce la coagulación del plasma, creando un andamio biológico que promueve la adhesión de las rodajas a los cubreobjetos.

Tome tubos de rodillos de lados planos con un orificio en el lado plano y un disco adhesivo unido alrededor del orificio en el exterior de los tubos.

Coloque los cubreobjetos en los discos adhesivos, asegurándose de que las rodajas de cerebro miren hacia el interior de los tubos.

Agregue un medio de cultivo neuronal a los tubos y fluya en una mezcla de dióxido de carbono y aire.

Tape los tubos, insértelos en una rejilla de rodillos e incube con un movimiento giratorio.

La aireación proporcionada por la incubación rodante y los nutrientes del medio apoyan el cultivo a largo plazo de los cortes de cerebro.

Para comenzar, prepare la rejilla para tubos de rodillos y haga una plantilla para ayudar a perforar un agujero en los tubos de rodillos, como se describe en el protocolo de texto adjunto. Con la plantilla, mantenga en posición un tubo de cultivo de plástico de 1 centímetro de lado plano para que el lado plano quede hacia arriba. Luego, taladre un orificio de 6 milímetros de diámetro con el centro a 1 centímetro de la parte inferior y centrado entre los lados del tubo.

Con la herramienta de desbarbado giratoria, alise los bordes del orificio y haga cuatro ranuras en el borde interior del orificio para facilitar el drenaje del orificio durante la rotación. A continuación, enjuague los tubos con etanol al 70% y luego séquelos al aire en un gabinete de seguridad biológica. Esterilice los tubos en unos discos adhesivos de caucho de silicona perforados de 12 milímetros durante 40 minutos bajo la lámpara UV.

Después de 20 minutos, vuelva a colocar los tubos y discos para esterilizar todas las superficies expuestas. A continuación, retire el respaldo blanco del disco adhesivo. Alinee los orificios y fije la goma de silicona al exterior del tubo.

Una vez obtenidas las rodajas, colocar 2 microlitros de plasma de pollo en el centro del lado fotograbado de un cubreobjetos preparado. Extienda el plasma ligeramente para lograr un punto de 3 a 4 milímetros de diámetro. Luego, use una espátula estéril de punta estrecha para levantar una rebanada de cerebro preparada. Use fórceps cerrados para mantener la rebanada en la punta de la espátula mientras levanta la rebanada. Toque la espátula con el punto de plasma en el cubreobjetos y, con las pinzas cerradas, empuje la rebanada sobre el cubreobjetos.

Agregue una capa delgada de plasma de pollito en el cubreobjetos antes de colocar la rebanada y una cantidad mínima de plasma tratado con trombina para cubrir la rebanada. Si la rebanada flota, no permanecerá adherida cuando se retire el coágulo.

A continuación, mezcle 2,5 microlitros de plasma y 2,5 microlitros de trombina en un tubo separado. Coloque rápidamente 2,5 microlitros de esta mezcla sobre y alrededor de la rebanada, y pipetee hacia arriba y hacia abajo suavemente para mezclarla. Retire la cubierta de plástico transparente del lado expuesto del adhesivo de caucho de silicona previamente fijado al tubo del rodillo. Luego, coloque el cubreobjetos con la rebanada de cerebro sobre el adhesivo, alineando la rebanada dentro del orificio.

Para asegurar la adhesión, aplique una presión suave y uniforme al cubreobjetos con el pulgar presionando el cubreobjetos hacia abajo de manera uniforme y manteniéndolo presionado durante aproximadamente 1 minuto mientras lo transfiere al gabinete de seguridad biológica.

La presión sobre el cubreobjetos para adherirlo al tubo sin fugas debe ser la correcta y mantenerse durante el tiempo suficiente para eliminar los canales de aire en el sellador. Demasiada presión agrietará el cubreobjetos.

En un gabinete de seguridad biológica, agregue 0,8 mililitros de medio de cultivo neurobasal A completo a cada tubo. Luego, haga fluir una mezcla de aire al 5% de dióxido de carbono y 95% a través de una pipeta de pasto estéril tapada con algodón sujeta de forma segura por una abrazadera. Utilícelo para enjuagar el tubo de rodillo con la mezcla de gas y tapar rápidamente el tubo a medida que se retira de alrededor de la pipeta.

A continuación, etiquete los tubos con el número de rebanada y el número de bastidor. Inserte los tubos en una gradilla de rodillos, asegurándose de que estén geométricamente equilibrados. Si hay un número impar de tubos, agregue tubos en blanco para equilibrar.

Coloque las gradillas en una incubadora de rodillos a 35 grados Celsius con rodillos girando la gradilla de rodillos para mantener el medio en el fondo de los tubos. Incline la incubadora hacia atrás aproximadamente 5 grados levantando su parte frontal sobre una tabla.