Inicio de la extensión y formación rápidas de neuritas Conexiones neuronales funcionales

Comience ensamblando un dispositivo microfluídico que contenga microcanales dentro de un plato recubierto con lisina.

Siembra neuronas embrionarias con un medio de crecimiento en los pozos microfluídicos, permitiéndoles fluir a través de los microcanales.

Incubar para facilitar la unión y el crecimiento neuronal, formando poblaciones neuronales físicamente aisladas.

Desmonte la configuración y coloque el plato en una cámara de micromanipulador con un flujo salino para mantener la viabilidad celular.

Introducir perlas recubiertas de lisina cerca de las neuronas, lo que permite que las neuritas o proyecciones celulares se adhieran y formen complejos de perlas-neuritas.

Usando un micromanipulador, aplique succión para activar un complejo de perla y neurita de un canal.

Tire de este complejo para inducir tensión mecánica, lo que lleva a una rápida extensión de la neurita.

Guíe esto hacia otro complejo de perlas-neuronas y sosténgalo con un segundo micromanipulador.

Mantenga ambas cuentas en su lugar para facilitar la formación de una conexión neurítica.

Libere la succión y reemplace la solución salina con un medio de cultivo.

Incubar para establecer conexiones funcionales entre neuronas, promoviendo la comunicación a través de neurotransmisores.

Retire el medio de los pocillos superiores de los dispositivos microfluídicos sin vaciar los pocillos. Luego, agregue 20 microlitros de la solución celular concentrada en el pocillo superior derecho del dispositivo microfluídico y verifique en el microscopio cómo fluyen las células dentro del dispositivo microfluídico de una sola población.

Para colocar células en placas en el dispositivo de poblaciones múltiples, agregue 20 microlitros de la solución celular concentrada en cada uno de los pocillos superiores. Bajo el microscopio, verifique si las células están dentro de las cámaras. Luego, coloque los dispositivos en la incubadora durante 15 a 30 minutos para promover la unión celular al sustrato.

Después de que las células se adhieran al sustrato, agregue 40 microlitros de NBM a los dos pocillos superiores del dispositivo de población única. Esto ayudará a eliminar las burbujas de aire de los microcanales. Agregue 20 microlitros de NBM a los pocillos superiores del dispositivo de poblaciones múltiples, los mismos pocillos donde se inyectaron las células. El medio debe sobresalir ligeramente para formar un menisco positivo y dar a los pocillos un aspecto de magdalena.

Uno o dos días antes de la extracción de los dispositivos microfluídicos, agregue 2 mililitros de NBM precalentado a cada placa de muestra e inunde las cámaras. Luego, mantenga los dispositivos en la incubadora. Posteriormente, use pinzas estériles y una punta de pipeta para quitar los dispositivos microfluídicos de los cubreobjetos, dejando una configuración estampada de neuronas.

En este procedimiento, agregue de 40 a 60 microlitros de las perlas recubiertas de PDL preparadas al cultivo celular. Luego, regrese la muestra a la incubadora durante una hora para promover la formación de contactos sinápticos. Posteriormente, instale la muestra en una configuración experimental de modo que las células puedan evaluarse desde arriba mediante dos micropipetas y también se pueda acceder ópticamente. En esta configuración, una cámara CCD se encuentra en el puerto lateral del microscopio para la captura de imágenes. Conecte cada pipeta llena de solución salina a una jeringa de 1 mililitro. A continuación, perfundir la muestra con solución salina fisiológica.

A continuación, bajo el microscopio, verifique la brecha entre las dos poblaciones neuronales aisladas para asegurarse de que las dos poblaciones no estén conectadas de forma natural. Seleccione una cuenta PDL que no esté unida a la neurona en el campo de visión. Alinee la perla con una punta de micropipeta enfocándose en la perla y luego en la micropipeta.

Posteriormente, baje la punta lo más cerca posible de la perla monitoreándola a través del microscopio. A continuación, aplique presión negativa a la pipeta para recoger el cordón y mantenga la presión negativa durante todo el experimento.

Ahora, seleccione una perla PDL unida a una neurona en el campo de visión y conéctela a la segunda micropipeta mediante succión. Tire del complejo PDL-perla y neurona moviendo lentamente el micromanipulador o la etapa de muestra a 0,5 micrómetros por minuto durante 1 micrómetro y haga una pausa de cinco minutos para permitir el inicio de la neurita.

Tire del complejo de perlas-neuronas PDL moviéndolo lentamente lateralmente a 0,5 micrómetros por minuto durante 2 micrómetros. Luego, haga una pausa de cinco minutos para permitir el alargamiento de la neurita. Después de un inicio exitoso y la extensión de la neurita durante los primeros 5 micrómetros, tire continuamente de la neurita a 20 micrómetros por minuto.

Para conectar las neuronas, seleccione una región rica en neuritas. Utilice otras perlas para medir la altura de la punta de la pipeta por encima del cubreobjetos y baje el complejo PDL-perla para que entre en contacto físico con las neuritas. Deje el complejo de perlas PDL-neurita en contacto con la neurita diana mientras manipula la segunda micropipeta. Luego, baje la segunda pipeta con la segunda perla PDL en la parte superior de la neurita recién formada a unos 20 micrómetros de la primera perla y use la segunda perla PDL para empujar el nuevo filamento de neurita hacia la célula diana.

A continuación, mantenga ambas cuentas en su lugar durante al menos una hora. Verifique la ausencia de hinchazón focal, un engrosamiento de las neuritas que entran en contacto con la perla con el microscopio. Durante este tiempo, cambie lentamente el medio de la muestra de solución salina fisiológica a NBM equilibrado con dióxido de carbono precalentado.

Libere el cordón de la segunda pipeta liberando la succión. Si la nueva neurita permanece adherida, suelte también la primera velocidad. Luego, vuelva a colocar cuidadosamente la muestra en la incubadora para fortalecer la conexión neuronal para futuros experimentos.