Generación y mantenimiento de cultivos de cortes a partir de tejido de glioblastoma humano

Tomemos el tejido de glioblastoma humano, un tumor cerebral primario que se origina en las células gliales.

Lave el pañuelo con un medio de procesamiento helado para eliminar la sangre residual.

Corta el tejido en trozos e insértalo en un molde de inclusión que contenga agarosa fundida.

Enfríe el molde, permitiendo que la agarosa polimerice y forme una matriz de gel estable.

Retire el bloque de tejido del molde y fíjelo en la placa de muestra de un vibrátomo.

Agrega el medio de procesamiento helado para sumergir el bloque. Pasar una mezcla de gases oxigenados para airear el medio, manteniendo la viabilidad del tejido.

Secciona el tejido tumoral incrustado en rodajas finas.

Transfiera una rebanada a una placa de Petri que contenga el medio de procesamiento helado para preservar la arquitectura del tejido.

Luego, coloque la rebanada de tejido en un inserto de membrana permeable en un pocillo que contenga un medio de mantenimiento de cultivo de rebanadas.

Mantener la loncha en condiciones fisiológicas. El cultivo de rebanadas está listo para los ensayos posteriores.

Comience usando pinzas estériles para colocar insertos de cultivo de PTFE vacíos en cada pocillo de una placa de seis pocillos que contenga 1 mililitro de medio de mantenimiento de cultivo en rodajas por pocillo. Cuando se hayan agregado todos los insertos, coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejidos con camisa de agua humidificada a 37 grados Celsius y 5% de CO₂.

A continuación, coloque los trozos de tejido tumoral en una placa de Petri que contenga un medio de procesamiento helado y use una pipeta para lavar suavemente el tejido tres veces con medio nuevo para eliminar los glóbulos rojos adheridos. Después del tercer lavado, use un bisturí para cortar las piezas tumorales en tiras de aproximadamente 3 por 3 por 10 milímetros, eliminando con cuidado los vasos adheridos y evitando el tejido necrótico o cauterizado.

Cuando se haya recortado todo el tejido, agregue de 5 a 7 mililitros de agarosa líquida a 37 grados Celsius en un molde de inclusión de plástico de 2 centímetros cúbicos y enfríe la agarosa sobre una cama de hielo durante un minuto. Coloque de 2 a 4 tiras de tejido en la agarosa, con el eje largo orientado verticalmente, dejando los tejidos en hielo durante otros 2 a 5 minutos después de su colocación.

Cuando la agarosa se haya solidificado, corte los lados del molde con un bisturí para retirar suavemente la agarosa del molde y use una generosa gota de pegamento de cianoacrilato para fijar el bloque de agarosa a una placa de muestra de vibratomo.

Cuando el pegamento se haya endurecido, sumerja el bloque de agarosa en un medio de procesamiento helado y use una pipeta de plástico estéril recortada para burbujear una mezcla de 5% de CO₂ 95% de O₂ en el medio dentro del depósito de vibratomo. Ajuste el grosor de la rebanada de vibratomo a 300 a 350 micras y ajuste la velocidad avanzada de la cuchilla y la amplitud de la cuchilla de acuerdo con la consistencia del tejido y las especificaciones del vibratomo.

Obtener el número adecuado de cortes de acuerdo con el análisis experimental planificado. Usando una microespátula de acero inoxidable para transferir las rodajas a una placa de Petri que contenga un medio de procesamiento helado a medida que se adquieren. Cuando se hayan adquirido todas las rebanadas, use la microespátula para transferir cada rebanada a un solo inserto de PTFE.

Después de una incubación de 12 a 24 horas, equilibre una nueva placa de seis pocillos que contenga medio de mantenimiento de cultivo de rodajas frescas en la incubadora de cultivo celular durante 15 minutos. Luego use pinzas estériles para agarrar cada inserto por el borde y transfiera los insertos a pocillos individuales de la nueva placa de seis pocillos.