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Comience agregando pericitos a la parte inferior del inserto de pocillos.
Cubra el inserto con una placa de cultivo e incube.
Los pericitos se adhieren a la membrana del inserto de pozo, formando una capa unicelular o una monocapa.
Tome otra placa de cultivo.
Agregue astrocitos humanos al pozo en un medio adecuado. Luego, incube el plato.
Los astrocitos se adhieren al fondo del pocillo y forman una monocapa.
Deseche el medio y agregue el medio de astrocitos y pericitos frescos.
Ahora, tome la placa de cultivo que contiene el inserto de pocillos con la capa de pericito.
Invierta la placa y transfiera el inserto del pocillo al pocillo que contiene la capa de astrocitos.
Agregue las células endoteliales del cerebro humano a la parte superior del inserto de pocillos e incube.
Las células endoteliales se adhieren al inserto del pocillo, formando un sistema de cultivo celular triple que se asemeja a la barrera hematoencefálica, una interfaz crucial que separa el torrente sanguíneo y el cerebro.
Comience cultivando HBVP en matraces de cultivo T75 con una superficie activada para la adhesión celular dentro de una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius hasta que sea confluente. Una vez alcanzada la confluencia, aspirar el medio parásito viejo y lavar las células con 5 mililitros de PBS de Dulbecco tibio. Aspire el PBS de Dulbecco y separe las células del matraz, utilizando una combinación de 4 mililitros de solución tibia de tripsina-EDTA y 1 mililitro de PBS de Dulbecco.
Incube el matraz durante 5 minutos a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono. Observe bajo un microscopio para confirmar si las células se desprenden del matraz. Agregue 5 mililitros de medio antiparasitario tibio, que contenga un 2% de FBS al matraz, y transfiera las células separadas a un tubo centrífugo de 50 mililitros. Centrifugar la suspensión celular durante tres minutos a 200 g, permitiendo que las células formen un gránulo en el fondo del tubo.
Aspire el medio del tubo, asegurándose de que el gránulo de la célula permanezca intacto. Vuelva a suspender el gránulo celular en medio parásito. Calcule la cantidad de medio, dependiendo de la confluencia de las células y la cantidad de insertos de pocillos necesarios. Tome 10 microlitros de las células resuspendidas. Colóquelos en un portaobjetos de conteo de celdas y cuente el número de celdas.
Determine la densidad celular y siembre 300,000 células por inserto en 1 mililitro de medio parásito en el lado luminal de los insertos de pocillos. Cultive astrocitos humanos primarios utilizando el medio de astrocitos, que contiene un 2% de FBS, como se describe en el manuscrito del texto. Determine la densidad celular y siembre 300.000 células por pocillo en el fondo de las placas de 6 pocillos de cultivo de tejidos. Cubra el plato para evitar la evaporación e incube durante la noche.
Saque las placas de 6 pocillos de cultivo de tejidos que contienen astrocitos en los insertos de pocillos que contienen pericitos de la incubadora. Aspire el medio de astrocitos de las placas de 6 pocillos de cultivo de tejidos y agregue 1 mililitro de medio de parásitos y 1 mililitro de medio de astrocitos a cada pocillo.
Aspire el medio de pericitos de los insertos de pocillos y colóquelos en las placas de 6 pocillos de cultivo de tejidos que contienen los astrocitos sembrados. Siembre HBMEC a una densidad de 300.000 células por pocillo en 2 mililitros de medio clásico completo en el lado apical de los mismos insertos de pocillos.