Un hidrogel a base de ácido hialurónico para el cultivo tridimensional de células de glioblastoma

Comience con gliomasferas, agregados celulares derivados de un tumor cerebral o glioblastoma.

Agrega enzimas de disociación. Incubar para separar las células de glioblastoma y obtener una suspensión unicelular.

A continuación, introduzca un medio de cultivo enriquecido con suero para detener la actividad enzimática.

Centrifugar y eliminar el sobrenadante, luego volver a suspender las células.

Filtre la suspensión, luego centrifugue y retire el sobrenadante.

Resuspender las células en precursores de hidrogel que contienen péptidos pequeños.

Cargue esta mezcla en pocillos con un molde de silicona preensamblado que contenga ácido hialurónico.

Mezclar la solución. Incubar para permitir la interacción entre el ácido hialurónico y los precursores del hidrogel, formando un hidrogel que facilita el atrapamiento celular.

Superponga el hidrogel con medios de cultivo para mantener la supervivencia celular.

Después de desmontar el molde, incube el hidrogel.

Dentro del hidrogel, las proteínas de adhesión en las células interactúan con los péptidos precursores y el ácido hialurónico.

Esto hace que las células formen pequeños grupos y desarrollen un cultivo tridimensional.

Para comenzar, coloque moldes de caucho de silicona limpios y secos en cada pocillo de una placa de 12 pocillos no tratada con cultivo de tejidos y use el extremo romo limpio de una punta de pipeta para adherir los moldes al fondo de la placa. Después de verificar el sello entre los moldes y los fondos de los pocillos, recolecte las esferas de glioma disociadas de un cultivo celular de glioblastoma por centrifugación y vuelva a suspender el gránulo en un mililitro de enzima de disociación celular.

Después de cinco minutos a temperatura ambiente, agite el tubo con golpecitos suaves y detenga la reacción enzimática con cuatro mililitros de medio completo. Centrifugar las células nuevamente y volver a suspender el sedimento en un mililitro de medio completo fresco antes de colar las células a través de un filtro de 70 micrómetros. Lave el colador con cuatro mililitros adicionales de medio completo y divida la suspensión en dos alícuotas de 8 x 10⁴ celdas por tubo de centrífuga.

Recoger las células por centrifugación, y resuspender un pellet en 80 microlitros de polietilenglicol maleimida recién preparado, o PEG-Mal-RGD, y un pellet en 80 microlitros de solución PEG-Mal-CYS recién preparada por molde. Con una punta de micropipeta de orificio ancho de 200 microlitros, agregue 40 microlitros de solución de ácido hialurónico en cada molde de silicona de goma, seguido de 40 microlitros de la solución celular PEG-Mal-CYS o PEG-Mal-RGD, pipeteando rápidamente hacia arriba y hacia abajo no más de 10 veces por molde para mezclar.

Debido al rápido tiempo de gelificación, una vez que se mezclan los dos componentes de hidrogel, es importante utilizar una punta de pipeta de orificio ancho para mezclar las soluciones de forma rápida pero completa. Este paso requiere práctica.

Luego, coloque las células encapsuladas en gel en una incubadora de cultivo celular de 37 grados Celsius y 5% de CO₂ durante 5 a 10 minutos. Al final de la incubación, agregue de 2 a 2,5 mililitros de medio de cultivo a cada gel y use una punta de pipeta estéril de dos microlitros y fórceps para separar suavemente los geles de los lados de los moldes. Luego, use fórceps esterilizados para quitar los moldes de los pocillos de la placa y devolver la placa a la incubadora de células.