Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 5:12 min. • July 8th, 2025
Comience con un cerebro de cachorro de ratón.
Aísle el cerebelo y obtenga cortes de tejido de grosor adecuado.
Transfiera las rodajas a insertos de membrana colocados dentro de los pocillos de placas de cultivo que contienen medios.
En los pocillos tratados, el medio contiene un compuesto de prueba neuroprotector. Los pozos de control carecen del compuesto. Incubar.
En condiciones de control, las células cerebelosas de Purkinje sufren apoptosis, imitando el desarrollo postnatal temprano in vivo.
En los pocillos tratados, dependiendo de su potencial, el compuesto puede proteger a las células de la apoptosis.
Lave las rodajas y fíjelas para preservar la integridad celular.
Transfiera las rodajas a una solución que bloquee la permeabilización para permeabilizar las membranas celulares y bloquear los sitios de unión no específicos.
Superposición con anticuerpos primarios dirigidos a una proteína de unión al calcio expresada específicamente en células de Purkinje.
Lave e introduzca anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos dirigidos a los anticuerpos primarios.
Contratiñe los núcleos con un tinte de unión al ADN y monta las rodajas.
Usando un microscopio confocal, cuantifique las células de Purkinje viables para identificar el potencial neuroprotector del compuesto de prueba
Para recolectar el cerebelo, use pinzas de vendaje rectas para agarrar la cabeza del cachorro por la nariz y use tijeras rectas para abrir el cuero cabelludo desde el extremo posterior lateralmente hasta la línea media. Corta el cráneo de la misma manera, apuntando las puntas de las tijeras hacia afuera para evitar dañar el cerebelo, y usa una espátula para transferir el cerebro a un plato de 60 milímetros que contenga HBSS frío y 5 miligramos por mililitro de glucosa.
Use las pinzas de vendaje recto para diseccionar cuidadosamente el cerebelo y use pinzas finas curvas estériles para colocar el tejido en un disco de plástico en la mesa de corte de un cortador de tejidos. Gire la mesa de corte para orientar el tejido para permitir la adquisición de secciones parasagitales y tire de la perilla de liberación de la mesa hacia la derecha para mover la mesa de corte hasta que la cuchilla se coloque en el borde del tejido. Luego, ajuste el grosor de la rebanada a 350 micrómetros y la velocidad de la cuchilla a media y encienda la picadora. Cuando se haya cortado todo el cerebelo, apague el picador.
Con unas pinzas estériles, sostenga el disco sobre un nuevo plato de 60 milímetros. Use una pipeta de transferencia para enjuagar HBSS más glucosa sobre el disco para que las rodajas caigan en el plato. Luego, tocando las muestras lo menos posible, use una microsonda para separar las rodajas.
Utilice la pipeta de transferencia para seleccionar las secciones del cerebelo cercanas al vermis en insertos de cultivo celular individuales en la placa de seis pocillos y utilice la microsonda para colocar las rodajas en el centro de cada inserto. Cuando se hayan colocado todas las rodajas, aspire cuidadosamente cualquier exceso de HBSS más glucosa y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular.
Para la tinción de inmunofluorescencia, retire el sobrenadante de cada pocillo y lave los insertos con PBS. Fije las rodajas con 1 mililitro de paraformaldehído frío al 4% en el pocillo de cada inserto y 500 microlitros encima de cada inserto durante 1 hora.
Al final de la fijación, lave los insertos cuatro veces durante 10 minutos con 1 mililitro de PBS fresco debajo de cada inserto y 500 microlitros de PBS fresco encima de cada inserto por lavado en un agitador orbital. Llene previamente cada pocillo de una placa de 24 pocillos con 500 microlitros de PBS-TB y use un pincel para transferir las rodajas cerebelosas de cada inserto de cultivo celular a pocillos individuales de una placa de 24 pocillos.
Permeabiliza y bloquea las rodajas a temperatura ambiente durante una hora. Al final de la incubación, marque las células con 200 microlitros del anticuerpo primario de interés diluido en PBS-TB por pocillo durante la noche a 4 grados Celsius en el agitador orbital.
A la mañana siguiente, lave las rodajas cuatro veces durante 10 minutos y 500 microlitros de PBS fresco por lavado en el agitador antes de etiquetar las muestras con los anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos apropiados durante dos horas a temperatura ambiente en el agitador protegido de la luz.
Al final de la incubación, contratiña las secciones con 500 microlitros de un tinte nuclear apropiado por pocillo durante 10 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz, y utiliza una pipeta de transferencia para montar las rodajas en portaobjetos de vidrio.
Luego, deje que las secciones se sequen al aire por completo antes de rehidratarlas con PBS y montar los pañuelos con cubreobjetos recubiertos con aproximadamente 80 microlitros de medio de montaje. Una vez que el medio de montaje se ha curado, las secciones cerebelosas están listas para ser fotografiadas.