Disociación y cultivo de neuronas a partir de muestras de tejido del hipocampo

0 vistas3:35 min • July 8th, 2025

Comience con muestras de tejido del hipocampo que contienen neuronas y varias células no neuronales.

Agregue una solución de enzima proteasa. La enzima degrada la matriz extracelular del tejido, iniciando la disociación celular.

Lavar con un medio de recubrimiento para eliminar las enzimas residuales.

Pipetear el tejido digerido repetidamente para disociar mecánicamente las células del tejido, formando una suspensión unicelular.

Centrifugar y eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender las celdas en el medio de recubrimiento.

Siembre las células en un cubreobjetos recubierto de poli-D-lisina en una placa de pocillos múltiples. La lisina mejora la unión celular.

Reemplace el medio de recubrimiento con un medio de mantenimiento neuronal que contenga nutrientes esenciales para la supervivencia de las neuronas.

Refresque la mitad del medio con medios de mantenimiento que contengan arabinosilcitosina o Ara-C.

Ara-C ingresa a las células e inhibe selectivamente el crecimiento de células no neuronales, lo que lleva a su muerte.

Reemplace los medios con medios de mantenimiento nuevos para apoyar la supervivencia de las neuronas.

Para disociar las neuronas del hipocampo para el cultivo, descongele la solución de enzima proteasa y precaliente el medio de siembra a 37 grados centígrados. A continuación, enjuague el hipocampo diseccionado con SLDS. Luego retírelo y agregue 2 mililitros de solución de enzima proteasa e incube la muestra a 37 grados centígrados durante 15 minutos.

Luego, lave los explantes del hipocampo con 5 a 10 mililitros de medio de recubrimiento dos veces y agregue 5 mililitros de medio de recubrimiento. Disociar los explantes del hipocampo en células individuales generando un pequeño vórtice utilizando una pipeta con una punta de plástico de 1 mililitro. Pipetear hacia arriba y hacia abajo unas 40 veces, evitando la formación de burbujas de oxígeno hasta que la solución se vuelva turbia y no queden grandes trozos de explante.

A continuación, centrifuga las células a 1.125 veces la gravedad durante 3 minutos. Retire el sobrenadante con las células sumergidas en medio y vuelva a suspender las celdas en 145 mililitros de medio de recubrimiento. Luego, agregue 1 mililitro de la suspensión celular por pocillo a una placa de 24 pocillos. Incube las células en el medio de recubrimiento a 37 grados centígrados durante dos a cuatro horas.

Luego, retire el medio de recubrimiento y reemplácelo con un medio de mantenimiento nuevo. Después de dos días, reemplace la mitad del medio con dos micromolares de Ara-C disueltos en medio de mantenimiento para inhibir el crecimiento de fibroblastos, células endoteliales y gliales. Luego, después de exponer las células a Ara-C durante dos días, reemplace el medio con medio de mantenimiento nuevo.

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Última actualización: 29 agosto 2026