JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 4:08 min • July 8th, 2025
Comience con colonias de células madre pluripotentes inducidas por humanos cultivadas en una matriz de membrana basal adherente.
Agregue un medio de diferenciación cerebelosa que contenga una hormona específica, factor de crecimiento e inhibidores de moléculas pequeñas.
Levante las colonias con una pipeta de vidrio y transfiéralas a una placa de fijación ultrabaja.
La superficie de baja adhesión mantiene las células en suspensión, facilitando su agregación en cuerpos embrioides tridimensionales, o EB.
La hormona, el factor de crecimiento y los inhibidores se unen a sus respectivos sitios diana, promoviendo la diferenciación de las células madre en progenitores neuronales.
Transfiera los EB a los pocillos de la placa de cultivo recubiertos con un polímero sintético y una proteína de adhesión para facilitar la unión de EB.
Reemplace el medio con un medio de diferenciación sin inhibidores.
Las células comienzan a migrar hacia afuera de los EB, formando una monocapa 2D.
Retire el medio y agregue un medio de maduración cerebelosa.
Los factores de crecimiento en el medio inducen la maduración de los progenitores neuronales en distintos precursores neuronales cerebelosos.
El día cero, agregue 1 mililitro de medio de diferenciación cerebelosa suplementado con 10 micromolares Y27632 y SB431542 a cada pocillo de un accesorio ultra bajo de seis pocillos o placa ULA, y colóquelo en la incubadora hasta que las colonias levantadas estén listas para agregarse a los pocillos. Limpie las células diferenciadas con una pipeta de vidrio estirado. Aspire el medio y agregue 1 mililitro de solución de paso iPSC por cada plato de 35 milímetros.
Después de tres minutos de incubación a 37 grados centígrados, aspire el medio y agregue 2 mililitros de medio de diferenciación cerebelosa suplementado con 10 micromolares Y27632 y SB431542. Con un aumento de 4X de un microscopio invertido de luz transmitida, levante las colonias con el borde doblado de la pipeta de vidrio extraída. Una vez que se levante cada colonia, transfiera suavemente todas las colonias a un pocillo de la placa ULA de 6 pocillos con una pipeta serológica de 10 mililitros. Repita este proceso para cada placa iPSC e incube las células a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono.
El día 2, agregue FGF2 a cada pocillo para ajustar una concentración final de 50 nanogramos por mililitro. El día 7, cambie un tercio del medio aspirando 1 mililitro de medio gastado y reemplazándolo con 1 mililitro de medio de diferenciación cerebeloso fresco. Incubar los cuerpos embrioides durante siete días.
El día 14, gire la placa para reunir todos los cuerpos embrioides en el centro de la placa. A continuación, incline la placa y aspire todo el medio gastado con una pipeta de 1000 microlitros desde el borde. A medida que disminuye la cantidad de medio, coloque lentamente la placa plana y continúe aspirando, dejando suficiente medio para evitar que se sequen los cuerpos embrioides.
A continuación, agregue 3 mililitros de medio de diferenciación cerebeloso fresco suplementado con 10 micromolares. Y27632. Luego, transfiera los cuerpos embrioides con una pipeta serológica de 10 mililitros a una placa recubierta de poli-L-ornitina laminina. El día 15, aspire el medio y reemplácelo con medio de diferenciación cerebeloso fresco.