Cultivo y mantenimiento de neuronas dopaminérgicas a partir de tejido cerebral embrionario de ratón

Tratar el tejido embrionario del mesencéfalo, rico en neuronas dopaminérgicas en desarrollo, con una solución de tripsina-EDTA para separarlas de la matriz tisular.

Agregue un medio de desactivación para inhibir la actividad enzimática y luego lave para eliminar las enzimas residuales.

Pipetea el tejido repetidamente. Las neuronas embrionarias poseen menos proyecciones, lo que reduce el estrés durante esta alteración y genera una suspensión unicelular.

Centrifugar y eliminar el sobrenadante, luego volver a suspender las neuronas en un medio completo. Transfiera estas neuronas a un cubreobjetos recubierto de polímero para la unión celular.

Coloque el cubreobjetos en una placa de pocillos múltiples con un medio completo, proporcionando nutrientes y factores de crecimiento esenciales para el crecimiento de las neuronas.

Los antibióticos en el medio previenen el crecimiento bacteriano, apoyando la viabilidad neuronal.

A medida que las neuronas crecen y maduran, desarrollan proyecciones celulares, como axones y dendritas, formando conexiones sinápticas.

Periódicamente, retire la mitad de los medios usados para eliminar los subproductos tóxicos.

Agregue un medio nuevo para el mantenimiento a largo plazo de las neuronas dopaminérgicas.

Debajo de una capucha, retire el HBSS de la colección de mesencéfalo ventral. Luego, agregue un mililitro de tripsina-EDTA tibia al 0,05%, suficiente solución para 12 piezas de tejido. Incube el tejido a 37 grados centígrados durante 5 a 10 minutos. Debajo del capó, reemplace la tripsina-EDTA con 1 mililitro de medio de desactivación.

Agite suavemente la mezcla y luego retire el medio de desactivación, pero deje suficiente medio para que las células disociadas no se descarten. A continuación, lave los tejidos con medio completo dos veces sin perder las células. Ahora, agregue 1 mililitro de medio completo. A continuación, triturar el tejido con la pipeta pulida al fuego, sin formar burbujas hasta obtener una suspensión unicelular. Alrededor de 8 a 10 pasadas deberían ser suficientes.

Después de la trituración, centrifugar las celdas de 400 g durante 5 minutos. Retire el medio y vuelva a suspender las células en 1 mililitro de medio completo. Pipetea las células hasta 4 veces para conseguir una suspensión. Comience contando y evaluando la salud de las células en la suspensión utilizando la exclusión de azul de tripano con un hemocitómetro.

Ahora, ajuste la suspensión celular a 1,500 células por microlitro. Luego, transfiera las tapas de los tubos de microcentrífuga esterilizadas a platos de 100 milímetros. Coloque los cubreobjetos preparados en las tapas con fórceps. No lave los cubreobjetos y trate de no dejar que se sequen. Cargue 100 microlitros de suspensión en cada cubreobjetos.

Este método algo inusual proporciona un 90% de viabilidad cultural y es un paso crítico para el éxito. Luego, cierre la placa de Petri y transfiérala a la incubadora durante una hora. Después de la incubación, transfiera cuidadosamente los cubreobjetos con el medio a placas de 24 pocillos, que contienen 400 microlitros de medio completo calentado a 37 grados Celsius en cada pocillo. Luego, incube las células durante la noche.

Las primeras horas son las más críticas para la supervivencia celular. Dentro de las 24 horas, agregue suavemente medio mililitro de medio completo a cada pocillo. Cada 2 semanas, cambie la mitad del medio. Si la cultura se vuelve amarilla, entonces el cambio de medio medio se puede realizar antes, pero el cambio aún debe ser poco frecuente. Las neuronas dopaminérgicas sobrevivirán durante más de 6 semanas en estas condiciones.