Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 4:48 min. • July 8th, 2025
Comience con fragmentos de tejido del tronco encefálico que contienen glioma pontino intrínseco difuso, un tumor derivado de células progenitoras gliales en un entorno rico en nervios mielinizados.
Tratar con enzimas proteolíticas para degradar la matriz extracelular del tejido.
Después de la incubación, pipetee repetidamente el contenido para facilitar la disociación celular y la degradación de la vaina de mielina.
Filtrar y centrifugar para recoger las células. Retire el sobrenadante y vuelva a suspenderlos en un tampón frío.
Agregue una solución de sacarosa para la separación del gradiente de densidad y mezcle bien.
A continuación, centrifuga para separar las células más pesadas de los restos de mielina más ligeros.
Retire la capa de mielina y agregue un tampón de lisis de glóbulos rojos.
Añadir un tampón frío para detener la acción de lisis. Centrifugar y retirar el sobrenadante para eliminar los glóbulos rojos lisados.
Vuelva a suspender las células en un medio neurobasal tibio y cultívelas en un matraz sin recubrimiento.
La ausencia de factores neurotrópicos provoca la muerte neuronal, mientras que las células progenitoras gliales utilizan nutrientes y factores de crecimiento, lo que conduce a la proliferación. Agregue medio fresco para mantener los niveles de factor de crecimiento.
Con el tiempo, estas células se agregan espontáneamente en grupos celulares, formando neuroesferas que flotan libremente.
En este procedimiento, centrifugar el tubo cónico que contiene los fragmentos de tejido restantes durante cinco minutos. Después de eso, retire el sobrenadante y agregue la solución de digestión enzimática precalentada de modo que haya 5 mililitros de solución de digestión por cada 1 mililitro de tejido. Luego, selle la tapa del tubo cónico con película de laboratorio e incube la reacción en un rotador a 37 grados centígrados durante 30 minutos.
Después de la incubación, triture las muestras suavemente. Con una pipeta serológica de 10 mililitros, pipetee la muestra hacia arriba y hacia abajo de 6 a 8 veces y evite generar burbujas de aire excesivas. A continuación, agregue una punta de pipeta de 1000 microlitros al extremo de la pipeta y triture la muestra de 6 a 8 veces más.
Deje que los trozos restantes se asienten en el fondo del tubo. Luego, retire y filtre el sobrenadante con la célula aún suspendida a través de un filtro de 100 micras en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros etiquetado como disociación enzimática y guárdelo en hielo. A continuación, centrifugar el tubo de disociación enzimática durante cinco minutos y continuar con la centrifugación en gradiente de sacarosa. Si la muestra aún está suspendida en solución, centrifugarla durante cinco minutos.
A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el tejido en 20 mililitros de HBSS frío sin calcio ni magnesio. Luego, lleve el volumen a 25 mililitros con HBSS frío. Lentamente, agregue 25 mililitros de solución de sacarosa 1.8 molar e invierta el tubo para mezclar. Esto da como resultado un gradiente de sacarosa molar de 0,9
.Posteriormente, centrifugar la muestra sin interrupción durante 10 minutos. Aspire con cuidado los restos de mielina y la mayor cantidad posible de solución de sacarosa. Luego, lave la muestra agregando 30 mililitros de HBSS frío sin calcio ni magnesio, y mezclando suavemente. Después de eso, centríelo durante cinco minutos.
En este procedimiento, retire el sobrenadante de lavado. Agregue 5 mililitros de tampón de lisis ACK y vuelva a suspender suavemente el gránulo celular, girando el tubo durante un minuto a temperatura ambiente. Luego, apague la lisis agregando 30 mililitros de HBSS frío sin calcio ni magnesio.
Posteriormente, centrifugarlo durante cinco minutos. Vuelva a suspender el sedimento celular final en 10 a 15 mililitros de TSM completo tibio con factores de crecimiento y cuantifique la densidad celular viable en un hemocitómetro utilizando la exclusión de azul de tripano. Luego, transfiera la suspensión celular final a un nuevo matraz de cultivo T75. Agregue factores de crecimiento adicionales cada dos días para mantener los niveles generales del factor de crecimiento y monitorear el desarrollo de neuroesferas de células tumorales.