Aislamiento y cultivo de progenitores granulares de neuronas cerebelosas murinas

Tomemos cerebella de cachorro de ratón.

Homogeneizarlos en fragmentos más pequeños.

Agregue una enzima proteolítica para digerir la matriz extracelular del tejido, aflojando los progenitores granulares cerebelosos, o CGNP, y los astrocitos.

Agregue medios de cultivo CGNP que contengan suero para detener la actividad enzimática. Centrifugar y desechar el sobrenadante rico en enzimas.

Vuelva a suspender los fragmentos de tejido en medios CGNP. Disociar mecánicamente el tejido para liberar las células.

Una vez que los desechos se asienten, transfiera el sobrenadante que contiene las células a un tubo nuevo.

Centrifugar y eliminar el sobrenadante con residuos.

Vuelva a suspender las células en medios CGNP y siembre en pocillos de placas de múltiples pocillos recubiertos con poli-D-lisina. Incubar.

Los astrocitos se asientan y se adhieren fuertemente al recubrimiento de poli-D-lisina, en comparación con los CGNP.

Agite la placa y recoja el sobrenadante que contiene CGNP. Centrifugar y eliminar el sobrenadante.

Vuelva a suspender los CGNP en medios CGNP y siembre en una placa de pocillos múltiples recubierta de poli-L-ornitina. Incubar.

Los CGNP se adhieren a la superficie recubierta y proliferan, ayudados por los componentes del medio y la poli-L-ornitina.

Transfiera de tres a cinco cerebelos en tubos de 15 mililitros. Lave el cerebelo con glucosa HBSS antes de centrifugar. Centrifugar los tubos para recolectar el tejido. Después del lavado final, homogeneice el cerebelo pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces con una pipeta de 1 mililitro hasta que los fragmentos tengan un tamaño de 0,5 a 1 milímetros cúbicos.

Retire suavemente todo el líquido hasta que queden 2,5 mililitros. Luego, agregue tripsina al 0,05% en el tubo con glucosa HBSS que contiene la cerebela e incube el tejido en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Invierta el tejido cada 1 a 3 minutos. Después de la incubación, detenga la digestión agregando 5 mililitros de medio de cultivo celular cGMP o CGM, y recolecte el tejido por centrifugación como antes.

Después de centrifugar, retire el sobrenadante y agregue 1 mililitro de MCG. Triturar el tejido con la punta de pipeta de 1 mililitro, evitando la formación de burbujas de aire. Luego, agregue 5 mililitros de MCG e incube la mezcla durante dos minutos en hielo para asentar los restos de tejido. Una vez que el tejido se haya asentado, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 mililitros. Luego, agregue 2 mililitros de MCG al tejido residual y repita el procedimiento de trituración antes de recolectar el sobrenadante y desechar los restos de tejido.

Reúna los sobrenadantes de cada tubo de tejido de 15 mililitros y centrifugue para recolectar las células cerebelosas. Vuelva a suspender el gránulo en 10 mililitros de MCG. Dado que los astrocitos se adhieren más rápido y más fuerte a la poli-D-lisina que las cGMP, agregue hasta 4 mililitros de suspensión celular a los pocillos de placas de 6 pocillos recubiertas de poli-D-lisina e incube durante 20 minutos a 37 grados Celsius para eliminar los astrocitos.

Agita el plato. Recoja el sobrenadante en un tubo de 15 mililitros y luego centrifugue el sobrenadante como antes. Vuelva a suspender el sedimento en 10 mililitros de MCG y cuente las células con una cámara de recuento de Neubauer. Después de 4 a 6 horas, los cGMP adheridos parecen redondos y proliferativos. Siembre las células en CGM en placas recubiertas de poli-L-ornitina e incube a 37 grados Celsius, 5% de CO₂ y 100% de humedad relativa.