Generación de esferoides a partir de células madre pluripotentes humanas

Comience con colonias de células madre pluripotentes humanas o hPSC unidas a un sustrato adecuado en un medio de cultivo.

Retire el medio. Agregue un medio neuronal que contenga inhibidores específicos e incube.

Estos inhibidores dirigen la maduración de las hPSC hacia un linaje neuronal, formando colonias neuroectodérmicas. Estos son precursores de pequeñas estructuras esféricas llamadas esferoides.

Retire el medio y lave con un tampón de sal.

Incubar con una enzima digestiva para separar las colonias de la placa.

Añadir el medio neuronal para detener la actividad enzimática.

Recoge las colonias y transfiérelas a un tubo.

Deje que se asienten y luego deseche el sobrenadante.

Resuspender las colonias en un medio neuronal que contenga un factor de crecimiento.

Transfiera las colonias a una placa de pocillos múltiples e incube.

Este factor de crecimiento facilita la autoorganización y multiplicación de las células neuroectodérmicas, llevándolas a formar un esferoide.

Para comenzar, coloque las colonias de hPSC en una matriz de membrana basal calificada por hESC desde un pocillo de una placa de 6 pocillos al 60% de confluencia en tres pocillos para lograr una densidad del 20% al 30%,