Generación de esferoides a partir de células madre pluripotentes humanas

Comience con colonias de células madre pluripotentes humanas o hPSC unidas a un sustrato adecuado en un medio de cultivo.

Retire el medio. Agregue un medio neuronal que contenga inhibidores específicos e incube.

Estos inhibidores dirigen la maduración de las hPSC hacia un linaje neuronal, formando colonias neuroectodérmicas. Estos son precursores de pequeñas estructuras esféricas llamadas esferoides.

Retire el medio y lave con un tampón de sal.

Incubar con una enzima digestiva para separar las colonias de la placa.

Añadir el medio neuronal para detener la actividad enzimática.

Recoge las colonias y transfiérelas a un tubo.

Deje que se asienten y luego deseche el sobrenadante.

Resuspender las colonias en un medio neuronal que contenga un factor de crecimiento.

Transfiera las colonias a una placa de pocillos múltiples e incube.

Este factor de crecimiento facilita la autoorganización y multiplicación de las células neuroectodérmicas, llevándolas a formar un esferoide.

Para comenzar, coloque las colonias de hPSC en una matriz de membrana basal calificada por hESC desde un pocillo de una placa de 6 pocillos al 60% de confluencia en tres pocillos para lograr una densidad del 20% al 30%, y luego, proceda con la inducción de colonias neuroectodérmicas 2D.

Agregue medios N2 nuevos suplementados con inhibidores duales de SMAD diariamente a cada pocillo durante los próximos 3 días. Para generar esferoides neuroectodérmicos 3D a partir de colonias neuroectodérmicas 2D inducidas, retire 2 mililitros de medio N2 de la placa de 6 pocillos y lave una vez con HBSS para asegurarse de que se elimine todo el medio N2.

Agregue 1 mililitro de dispasa a cada pocillo que contenga colonias. Incube la placa durante 20 a 25 minutos a 37 grados centígrados y verifique si la colonia se desprende regularmente. Al final de la incubación, para detener la actividad de la enzima dispasa, agregue 1 mililitro de medio N2 al pocillo. Con una punta de pipeta P1000 de gran calibre o una copa de punta de pipeta P1000 modificada con tijeras estériles, transfiera las colonias a un tubo de 15 mililitros y deje que los grupos de colonias se hundan hasta el fondo del tubo por gravedad.

A continuación, con una punta de pipeta P1000 estándar, retire con cuidado el sobrenadante. Reemplácelo con 1 mililitro de medio N2 fresco y repita el lavado tres veces para garantizar la eliminación completa de la dispasa. Después de volver a suspender los grupos celulares y el medio N2, transfiera la suspensión celular a un pocillo de una placa de 6 pocillos y agregue 40 nanogramos por mililitro de bFGF.