JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 2:57 min • July 8th, 2025
Tome un dispositivo microfluídico recubierto con un polímero sintético y una proteína de adhesión.
El dispositivo consta de pozos y cámaras de cultivo interconectadas separadas por microranuras.
Las cámaras contienen orificios perforados para la colocación de tejidos.
Obtener los ganglios del trigémino, una colección de cuerpos celulares de neuronas del trigémino, y gérmenes dentales, estructuras prenatales que se convierten en dientes adultos, de un embrión de ratón.
Coloque los tejidos en los orificios y agregue los medios de cultivo respectivos.
Los nutrientes y vitaminas en los medios de los gérmenes dentales facilitan la supervivencia de los gérmenes dentales durante el cultivo.
La superficie del dispositivo recubierto y los factores de crecimiento en los ganglios medios del trigémino facilitan el crecimiento de neuritas y axonales.
Los axones llegan a la cámara germinal del diente a través de los microsurcos.
Las señales derivadas del diente conducen a la repulsión neuronal, lo que permite que los axones rodeen el germen del diente sin inervarlo.
Lave las cámaras de cultivo con tampón y fije los tejidos con un fijador.
La cocultura ahora está lista para un análisis más detallado.
Después de la disección de los ganglios del trigémino y los gérmenes dentales, retire la laminina de los dispositivos microfluídicos y llene las cámaras con 200 microlitros de los medios respectivos. Con fórceps, transfiera suavemente los ganglios del trigémino disecados y los gérmenes dentales a los orificios creados con un punzón de biopsia. Asegúrese de que los gérmenes de los dientes no floten y que se hundan hasta que entren en contacto con los cubreobjetos.
Cultive las muestras en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Cambie el medio de cultivo cada 48 horas durante 10 días. Para cambiar el medio, primero, retire el medio apuntando la pipeta hacia el lado externo de los pocillos. Luego, agregue el medio fresco precalentado en el lado de los pocillos ubicados frente a las cámaras.
Durante el período de cultivo, obtenga imágenes de los cocultivos en cualquier momento utilizando microscopía óptica. Después del período de cultivo, lave las cámaras pipeteando 150 microlitros de PBS en un pocillo por cámara y dejando que el PBS fluya a través de las cámaras. Repita el lavado un total de tres veces.
Después del último lavado, retire el PBS y fije las muestras pipeteando 150 microlitros de paraformaldehído al 4% en PBS en un pocillo por cámara y dejando que fluya a través de la otra cámara. Incube el dispositivo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego, lave las cámaras dos veces con PBS y proceda con análisis adicionales, como tinción de inmunofluorescencia e imágenes del crecimiento.