Aislamiento de células madre del cerebelo postnatal de ratón y diferenciación en células neurales

0 vistas4:04 min • July 8th, 2025

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Tome células aisladas de un cerebelo de ratón recién nacido que contenga células madre, neuronas y glía.

Agregue microperlas magnéticas recubiertas de anticuerpos que se unen a una glicoproteína de superficie específica de células madre.

Centrifugar, quitar las perlas sueltas y volver a suspender las celdas en un tampón.

Cargue las células en una columna de separación colocada en un separador magnético, que retiene las células madre unidas a microperlas mientras otras células fluyen.

Agregue un medio de neuroesfera para eluir las células y transferirlas a una microplaca. Incubar para inducir la formación de neuroesferas primarias, colonias de células madre que se renuevan a sí mismas.

Centrifugar y desechar el medio. Vuelva a suspender las neuroesferas en un medio que contenga enzimas para digerir las proteínas de adhesión celular.

Centrifugar y eliminar las enzimas. Añadir el medio neurosphere y disociar mecánicamente las células.

Incubar para permitir la proliferación de células madre y la formación de neuroesferas secundarias, mientras que las células diferenciadas que carecen de características de células madre no proliferan.

Transfiera las neuroesferas a un medio de diferenciación e incube, promoviendo la diferenciación en neuronas y glía.

Coloque los tubos de centrífuga en hielo, luego, cuele las células disociadas a través de un colador de células de 40 micrómetros en un tubo de 50 mililitros. Cubra el filtro con 10 mililitros de solución HBSS helada para asegurarse de que las células pasen a través de la malla.

Transfiera las células filtradas a un tubo de centrífuga nuevo de 15 mililitros y centrifugue la suspensión a 300 veces g durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Luego, use un aspirador de vacío para eliminar el sobrenadante por completo.

Vuelva a suspender el sedimento celular en 160 microlitros de tampón de columna magnética helada. Agregue 40 microlitros de microperlas anti-prominina-1 a la suspensión celular. Luego, incube los tubos en un refrigerador durante 15 minutos, para permitir que el anticuerpo se una a las células que expresan prominina-1.

Lave las células con 1 a 2 mililitros de tampón de columna X y centríquelas a 300 veces g durante 10 minutos. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 1 mililitro de tampón de columna X. Coloque las columnas magnéticas en el soporte magnético y enjuáguelas una vez con 500 microlitros de tampón X. Aplique la suspensión celular etiquetada en la columna y recoja el flujo en tubos nuevos de 15 mililitros.

Lave la columna tres veces con 500 microlitros de tampón X. Luego, retire las columnas del campo magnético y colóquelas en tubos de 1,5 mililitros. Agregue 1 mililitro de medio de cultivo y empuje el émbolo en la columna para eliminar las células etiquetadas con perlas de prominina-1.

Para pasar las neuroesferas, transfiéralas junto con el medio de cultivo a un tubo centrífugo estéril de 15 mililitros. Granular las neuroesferas por centrifugación a 300 veces g durante 5 minutos y desechar el sobrenadante.

Vuelva a suspender el gránulo en 5 mililitros de medio de disociación con papaína o solución de tripsina al 0,05% e incube las células a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Centrifugar de nuevo la suspensión celular. Luego, vuelva a suspender las células en 5 mililitros de medio neurosphere y disociarlas pipeteándolas lentamente hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta de pasto. Coloque las células en medios de neuroesferas como se describe en el protocolo de texto y enriquézcalas con neuroesferas secundarias después de 7 a 10 días en cultivo como se describió anteriormente.

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Última actualización: 15 agosto 2026