JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 3:49 min • July 8th, 2025
Comience con un músculo de cabeza de rata y córtelo en fragmentos.
Agregue un cóctel de enzimas proteolíticas e incube agitando suavemente.
Las enzimas digieren la matriz extracelular del tejido, aflojando las fibras musculares.
Agregue medios que contengan proteínas séricas para inactivar las enzimas.
Transfiera el tejido a un tubo, centrifugue y deseche el sobrenadante.
Vuelva a suspender el tejido en el medio. Repita la interrupción mecánica y la centrifugación dos veces para obtener una suspensión homogénea de células satélite, células madre cruciales para la reparación y regeneración muscular.
Recoge el sobrenadante que contiene la célula satélite.
Pasar a través de un colador celular para obtener una suspensión unicelular. Centrifugar, desechar el sobrenadante y volver a suspender las células en el medio.
Coloque gotas de la suspensión celular en los pocillos de portaobjetos de la cámara recubiertos de proteínas de la matriz extracelular.
La superficie recubierta facilita la fijación de la célula satélite. Agregue medios a los pocillos.
Los factores de crecimiento en los medios inducen la proliferación y diferenciación de células satélite en mioblastos, precursores de células musculares, que proliferan y se fusionan para formar miotubos multinucleados.
Los miotubos eventualmente maduran y se convierten en fibras musculares.
Para aislar las células satélite, transfiera cada músculo a pocillos individuales de una placa de seis pocillos y corte los tejidos en pequeños trozos de 2 milímetros, teniendo cuidado de no picar demasiado los músculos. A continuación, incube cuidadosamente los fragmentos de tejido en 2,5 mililitros de solución de pronasa al 0,1% por pocillo a 37 grados centígrados durante 60 minutos, agitando suavemente, cada 20 minutos.
Cuando los haces de fibras exhiban una apariencia suelta, agregue 2.5 mililitros de DMEM, suplementados con suero de caballo y antibióticos a cada pocillo, y transfiera los tejidos digeridos a tubos cónicos individuales de 15 mililitros. Gire los lodos de tejido y decantar los sobrenadantes. Luego, agregue 5 mililitros de medio a cada tubo y homogeneice el tejido con una pipeta de plástico de 10 mililitros.
Vuelva a girar los tejidos y transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos cónicos de 15 mililitros. Luego, agregue 5 mililitros más de medio a los tubos y triture las piezas de tejido nuevamente hasta que los fragmentos pasen fácilmente a través de la pipeta.
Después de otra centrifugación, agrupe los sobrenadantes en los tubos correspondientes apropiados y filtre las suspensiones celulares a través de filtros de 40 micrómetros en tubos individuales de 50 mililitros. Lave los coladores con 1 mililitro de DMEM para obtener la máxima recuperación celular. Luego, gire las celdas. Vuelva a suspender los gránulos en medio fresco y cuente las células.
Para cultivar las células satélite aisladas, a continuación, diluya las suspensiones celulares a 1,5 x 103 células por 10 microlitros de medio de cultivo. Luego, agregue 10 microlitros de células en cada punto de gel de matriz extracelular previamente preparado e incube los geles a 37 grados centígrados. Después de seis horas, agregue cuidadosamente 400 microlitros de medio de cultivo a cada punto de gel y devuelva los portaobjetos a la incubadora. Después de tres días, inicie la diferenciación de las células con la adición del medio de cultivo apropiado.