Neurogénesis inducida por ácido retinoico utilizando células de carcinoma embrionario de ratón

Tome una suspensión celular de carcinoma embrionario de ratón capaz de diferenciarse en varios tipos de células.

Células semilla en una placa de cultivo hidrofóbica que contiene medios y ácido retinoico.

incubar. Las superficies hidrofóbicas evitan la adhesión celular, lo que hace que las células formen agregados.

El ácido retinoico ingresa a los agregados celulares, desencadenando vías de señalización y provocando la diferenciación en células progenitoras neuronales.

Después de la incubación, recolecte los agregados celulares.

Deseche el papel.

Agregue medios que contengan ácido retinoico y siembre los agregados en una placa de cultivo hidrofóbica.

incubar. El ácido retinoico facilita la diferenciación celular sostenida en neuronas.

Recoge los agregados y retira los medios.

Agregue una enzima proteolítica para interrumpir las adhesiones célula-célula dentro de los agregados.

Agregue medios que contengan suero para detener la actividad enzimática.

Disociar mecánicamente los agregados, formando una suspensión neuronal.

Centrifugar y desechar el sobrenadante rico en enzimas.

Vuelva a suspender las neuronas en el medio y sembrégalas en una placa adherente de múltiples pocillos que contenga el medio.

incubar. Las neuronas se adhieren a la placa y maduran, extendiendo proyecciones largas.

Para la generación de agregados, comience agregando 10 mililitros de medio de diferenciación suplementado con 5 microlitros de RA a una placa de cultivo no tratada de 100 mililitros. Siembre 1 millón de células en la placa de cultivo e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante dos días para promover la formación de agregados.

Después de la incubación, con una pipeta de 10 mililitros, aspire el medio que contiene los agregados y transfiéralo a un tubo de 15 mililitros a temperatura ambiente. Espere 1,5 minutos para que los agregados se asienten en la parte inferior y luego deseche el sobrenadante.

Agregue 10 mililitros de medio de diferenciación fresco suplementado con 0,5 RA micromolar. Siembre suavemente los agregados en una nueva placa de cultivo no tratada de 100 milímetros e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante dos días.

Para comenzar, use una pipeta de 10 mililitros para transferir los agregados celulares a un tubo de 15 mililitros. Espere 1,5 minutos a temperatura ambiente para que los agregados se asienten en el fondo y luego deseche el sobrenadante. Lave los agregados con suero y DMEM sin antibióticos. Espere a que los agregados de células se asienten en la parte inferior. Deseche el sobrenadante y agregue 2 mililitros de tripsina EDTA al 0,25%.

Incube el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 10 minutos, golpeando cada dos minutos para mantener las células en suspensión. A continuación, añadir 4 mililitros de medio de mantenimiento para detener la actividad de la tripsina, y pipetear hacia arriba y hacia abajo 20 veces con una pipeta de 1 mililitro.

Finalmente, centrifugar las células a 200 veces g y temperatura ambiente durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular en 5 mililitros de medio de mantenimiento. Utilice un contador de celdas para determinar el número de celdas y proceda con el placado de las celdas. Para colocar células en placas, primero, agregue 3 mililitros por pocillo de medio de mantenimiento a una placa de cultivo de seis pocillos. Luego, siembre las células a una densidad de 500,000 por pocillo. Incube la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.