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Neurociencia
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Comience con células madre embrionarias cultivadas sobre una capa de células alimentadoras de fibroblastos, que mantienen las células madre en su estado indiferenciado.
Agregue enzimas tripsina y EDTA para interrumpir la adhesión de célula a célula y separar las células.
Más tarde, agregue un medio de cultivo enriquecido con suero para detener la actividad enzimática y transfiera la suspensión celular a un tubo.
Centrifugar para recolectar las células, eliminar el sobrenadante y luego volver a suspender las células en un medio que contenga ácido retinoico.
Coloque las gotas de esta suspensión celular en la base de una placa de cultivo no adhesiva.
Invierta la base para formar gotas colgantes y colóquela sobre la tapa de la placa de cultivo llena de un tampón para evitar que las gotas se sequen.
En las gotas colgantes, la gravedad hace que las células se asienten en el fondo, y eventualmente se agreguen en estructuras tridimensionales denominadas cuerpos embrioides.
Además, las células absorben ácido retinoico, que modula varias vías de señalización intracelular.
Esta modulación estimula la diferenciación de las células madre en células progenitoras neurales con la capacidad de producir neuronas.
Comience la formación del cuerpo embrioide recolectando células madre embrionarias con tripsina-EDTA al 0,25% durante 2 a 5 minutos a 37 grados Celsius, dióxido de carbono al 5%. Agregue el medio de Dulbecco modificado de Iscove fresco o IMDM con 15% de FBS a las celdas de desprendimiento, luego transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros.
Centrifugar a 160 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Luego, cuente las células con un hemocitómetro y prepare una suspensión de 5 x 105 células por mililitro en IMDM con ácido retinoico 0.5 micromolar. A continuación, use una pipeta de 8 canales y puntas de 200 microlitros para colocar gotas de 120 microlitros por placa de Petri de 100 mililitros. Invierta el plato y llene la tapa invertida con PBS para evitar que las gotas colgantes se sequen. Cultivar a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono durante 3 a 4 días.