Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 4:27 min. • July 8th, 2025
Tome cultivos adherentes de células precursoras primarias de oligodendrocitos, u OPC, en un medio de crecimiento.
Agregue vectores lentivirales de control al pozo de control y vectores de prueba, que codifican proteínas de señalización que regulan la mielinización, al pozo de prueba, luego incube.
Las células internalizan los vectores y el ARN viral se transcribe inversamente en ADN y se incorpora al genoma del huésped, expresando las proteínas de señalización en las células de prueba.
Introducir enzimas para separar los OPC del sustrato.
Neutralice las enzimas y centrifugue para eliminar las enzimas.
Agregue el medio de crecimiento y transfiera los OPC a cubreobjetos dentro de una microplaca con ganglio de la raíz dorsal adherido o neuronas DRG. Permita que los OPC se asienten.
Llene los pozos con el medio de cultivo e incube. La interacción con las neuronas DRG desencadena la maduración de OPC en oligodendrocitos.
Las proteínas de señalización expresadas inducen a los oligodendrocitos a formar vainas de mielina alrededor de las neuronas DRG.
Evaluar la formación de la vaina de mielina inducida por proteínas de señalización en las células de prueba en comparación con las células transducidas por vectores de control.
Para este protocolo, haga que las células precursoras primarias de oligodendrocitos, OPC, se cultiven en placas de 10 centímetros con 10 mililitros de medios SATO que contengan los siguientes factores de crecimiento: CNTF, PDGF, NT3 y Forskolin. Las células deben haber sido cultivadas durante 24 horas bajo dióxido de carbono al 8%.
Comience aspirando el medio y retírelo por completo. Luego, reemplácelo con 10 mililitros del mismo medio con los factores de crecimiento. Infecte sus OPC con lentivirus, expresando la proteína de interés agregando el volumen requerido de virus gota a gota en el medio.
Además, en una placa OPC separada, mezcle el lentivirus de control que expresa solo GFP en el medio. Cultive las células durante otras 48 horas, luego recolecte las OPC de las placas para sembrarlas en las neuronas DRG cultivadas.
Primero, enjuague cada plato con 8 mililitros de EBSS dos veces. Prepare 1 mililitro de tripsina-EDTA al 0,05% con 9 mililitros de EBSS tibio. Agregue 5 mililitros de tripsina diluida a cada plato. Incube a 37 grados centígrados durante un máximo de dos minutos. Neutralice la tripsina agregando 5 mililitros de FBS al 30% en EBSS.
Luego, con una pipeta de 10 mililitros, lave los OPC de la superficie de la placa. Gire la placa un cuarto de vuelta cada vez para recoger todas las células. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros. Centrifugar las células a temperatura ambiente durante 15 minutos a 180 g.
Ahora, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular en un mililitro de medio SATO tibio sin factores de crecimiento, y cuente las células. A continuación, prepare las neuronas DRG que se cultivan en los cubreobjetos de 22 milímetros aspirando completamente el medio de su placa.
Luego, siembre suavemente 200,000 OPC, gota a gota, en cada cubreobjetos. El volumen de siembra debe ser inferior a 200 microlitros por cubreobjetos. Deje que las células se asienten sin mover la placa. Después de 10 minutos, cubra cada pocillo con un mililitro de medio SATO tibio. Ahora vuelva a enchapar los OPC hermanos restantes con medios SATO que contengan factores de crecimiento. Se pueden utilizar más tarde para verificar la expresión de la proteína de interés.