Aislamiento de neuronas ganglionares vestibulares del oído interno de un ratón

Tome la mitad de la cabeza de un cachorro de ratón y extraiga el cerebro.

Corta la parte superior del cráneo y extirpa el tejido circundante para visualizar la cápsula ótica, una capa externa ósea que protege las estructuras del oído interno.

Transfiera el tejido a una placa de cultivo que contenga un medio tamponado.

Separar los ganglios vestibulares superior e inferior, que contienen los cuerpos de las células nerviosas vestibulares.

Afeite la cresta ósea y coseche el ganglio superior subyacente.

Transfiera el ganglio superior a una placa nueva que contenga el medio tamponado.

Retire los tejidos adherentes de la superficie para limpiar el ganglio aislado.

Coloque el ganglio en una solución que contenga enzimas proteolíticas.

Las enzimas degradan la matriz extracelular del tejido, aflojando las células.

Transfiera el ganglio a una placa con fondo de vidrio recubierta de polímero que contenga medio de cultivo y disocie mecánicamente el tejido para liberar las células.

Incubar, permitiendo que las células se adhieran y establezcan un cultivo de neuronas ganglionares vestibulares.

Saque el cerebro del ratón sacrificado con unas tijeras quirúrgicas cerradas. Cortar y extirpar el nervio craneal para separar completamente el cerebro del cráneo. Comenzando en la parte posterior de la cabeza, retire el material membranoso transparente con fórceps y luego corte la parte superior del cráneo con unas tijeras quirúrgicas.

Retire el exceso de tejido de la parte posterior de la cabeza y el cuello, para que el área de disección y la cápsula ótica estén más limpias y de fácil acceso. Transfiera el tejido a una segunda placa de Petri con una solución L-15 fresca. Luego, ubique la cápsula ótica y los nervios auditivos, vestibulares superiores y vestibulares inferiores. Separe los ganglios superior e inferior con unas tijeras de resorte pequeñas y corte el nervio auditivo.

Con un bisturí, afeite suavemente la cresta ósea para debilitar el área ósea debajo de la cual el nervio se sumerge en la cápsula ósea. Retire con cuidado los desechos con un bisturí, exponiendo toda la parte hinchada del ganglio.

Use las tijeras finas de resorte para cortar y separar el ganglio de la rama nerviosa periférica que se sumerge hacia el utrículo. Retire el ganglio superior con pinzas finas y transfiéralo a una placa de Petri de 35 milímetros con una solución L-15 fresca.

Después de precalentar la solución enzimática, vierta la mezcla de enzimas en una placa de Petri de 35 milímetros y colóquela en una incubadora a 37 grados centígrados durante 10 a 15 minutos. Limpie el ganglio con fórceps finos y pequeñas tijeras de resorte eliminando el hueso, el exceso de tejido, las fibras nerviosas y cualquier otra estructura superflua. Tenga cuidado de minimizar la extirpación de cualquier tejido ganglionar.

Transfiera los ganglios limpios a la solución enzimática precalentada y vuelva a colocarla en la incubadora durante 10 a 40 minutos. Luego, transfiera los ganglios a la placa de Petri de 35 milímetros con una solución L-15 fresca.

Después de dos o tres minutos, transfiera los ganglios a otra placa de Petri de 35 milímetros llena de medios de cultivo filtrados. Transfiera aproximadamente 150 microlitros de medios de cultivo filtrados a un plato con fondo de vidrio recubierto. Luego, transfiera la cantidad deseada de ganglios al cubreobjetos.

Extraiga una pequeña cantidad de medios de cultivo de la placa de cultivo y enjuague la pipeta de trituración con medio para evitar que el tejido se pegue a los lados de la pipeta de vidrio. Triture pasando suave y repetidamente el tejido a través de la pipeta hasta que los ganglios estén lo suficientemente disociados.

Después de cinco minutos, verifique bajo un microscopio óptico para ver si las células se han asentado en el cubreobjetos. Coloque con cuidado una placa de cultivo en una incubadora a 37 grados centígrados durante 12 a 24 horas.