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Tomemos la corteza de un cachorro de ratón.
Agregue una enzima proteolítica que digiera la matriz extracelular del tejido. Luego, disociar mecánicamente el tejido, aflojando las células.
Agregue medios gliales y ADNasa para degradar cualquier ADN contaminante.
Disociar mecánicamente el tejido para liberar neuronas y células gliales.
Una vez que el tejido no digerido se asiente, recoja el medio que contiene las células y centrifuge. Retire el sobrenadante.
Resuspenda las células en los medios gliales y colóquelas en un matraz recubierto de proteína de matriz extracelular.
incubar. Los astrocitos se adhieren más fuertemente a la superficie recubierta que otras células. Los medios gliales promueven solo la supervivencia de las células gliales.
Reemplace el medio para eliminar los residuos.
Incubar agitando para separar las células precursoras de oligodendrocitos suprayacentes, OPC y microglía.
Transfiera el medio con las células a una placa de cultivo.
Incubar con agitación para facilitar la adhesión microglial diferencial.
Transfiera el sobrenadante OPC no adherente a una placa multipocillo recubierta de poli-D-lisina. Incubar para la adherencia a OPC.
Reemplace los medios con medios OPC, lo que permite el crecimiento de OPC.
Agregue 1 mililitro de tripsina al 0,05% con EDTA 0,53 milimolares a cada tubo con tejido. Triture la mezcla con una pipeta de 10 mililitros aproximadamente 20 veces. Luego, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico vacío de 50 mililitros.
Incube la solución a 37 grados centígrados y dióxido de carbono al 5% durante 15 minutos, agitando suavemente los lisados después de ocho minutos. Después de la incubación, agregue 5 mililitros de MGM y 200 microlitros de DNasa-I a cada tubo para obtener una concentración final de 50 microgramos por mililitro. Triture cada lisado 10 veces con una pipeta de 10 mililitros.
Luego, deje reposar la suspensión celular durante tres minutos a temperatura ambiente para permitir que el tejido no disociado se asiente en el fondo del tubo. Transfiera las suspensiones celulares a nuevos tubos cónicos de 50 mililitros, dejando atrás el tejido no disociado. Después de la centrifugación, vuelva a suspender el gránulo celular en 5 mililitros de MGM y tritúrelo 20 veces.
Coloque las suspensiones celulares en matraces T-25 recubiertos e incube las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Para realizar el aislamiento de células precursoras de oligodendrocitos, agite las células durante 15 horas. Luego, retire el sobrenadante del matraz y colóquelo en una placa de Petri estéril.
Incube el sobrenadante a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos, girando después de 15 minutos para eliminar la microglía restante. Retire el sobrenadante celular no adherente. Cuente las células y colóquelas en una superficie recubierta de poli-D-lisina a la concentración deseada.
Regrese las células a la incubadora durante al menos una hora. Luego, aspire suavemente el 95% del medio y agregue lentamente el medio OPC tibio, pipeteándolo contra la pared del pocillo para minimizar la interrupción de los OPC.