Aislamiento y cultivo de neuronas motoras oculomotoras, trocleares y espinales de un embrión de ratón

Tome un ratón preñado transgénico y extirpe quirúrgicamente el útero con embriones que contengan neuronas motoras marcadas con fluorescencia.

Transfiera el útero a un plato con un tampón helado bajo un microscopio de fluorescencia.

Utilice luz visible para aislar los embriones.

Retire la cara y la cola de los embriones y oriéntelos a una posición prona.

Usando la señal de fluorescencia, haga una incisión en el mesencéfalo para exponer los núcleos oculomotor y troclear, que contienen neuronas motoras.

Aísle el mesencéfalo que contiene los núcleos.

Abrir el lado dorsal del rombencéfalo y la médula espinal. Aísle la médula espinal, extirpe ambos extremos y recoja las columnas que contienen neuronas motoras espinales.

Tratar los tejidos recolectados con enzimas para disociar la matriz tisular. Recolecte las células individuales y aísle las neuronas marcadas con fluorescencia usando FACS.

Agregue un medio de cultivo a las neuronas aisladas, transfiera las células a una microplaca recubierta de sustrato de cultivo e incube, permitiendo que las células se adhieran y crezcan.

Mantener las neuronas motoras en cultivo.

Comience recolectando embriones positivos para EGF de Islet-1 de un ratón preñado aproximadamente 11,5 días después de la fertilización. Rocíe bien el abdomen con etanol y retire el útero con tijeras de microdisección estériles y unas pinzas para vendar el pulgar. Lave brevemente el útero en PBS estéril. Luego, transfiéralo a la placa de disección llena de PBS estéril preenfriado.

Bajo la luz brillante del microscopio, retire con cuidado los embriones del útero con tijeras de microdisección, pinzas para vendar el pulgar y pinzas Dumont Número 5. Luego, use una cuchara estéril miniperforada Moria para transferir cada embrión a un pocillo separado de una placa de 24 pocillos llena de medio de baja fluorescencia Hibernate E preenfriado suplementado con 1X V27.

Mientras mantiene la placa en hielo, transfiera un embrión a una placa de disección estéril y cúbralo completamente con una solución salina equilibrada estéril de Hank o HBSS. Use pinzas para quitar la cara del embrión y la cola sin dañar el mesencéfalo. Luego, coloque el embrión boca abajo con las extremidades a horcajadas y la cola apuntando hacia el frente del microscopio.

Use pinzas para abrir el techo del cuarto ventrículo para generar una pequeña abertura. Utilice esta abertura para enganchar pinzas en el espacio creado entre el cuarto ventrículo y su techo. Diseccionar a lo largo de la superficie dorsal del embrión rostral a la corteza y lateral a la placa del piso y la columna motora.

Luego, abra el tejido diseccionado a libro abierto para revelar los núcleos CN3 y CN4 positivos para GFP. Separe con cuidado el mesencéfalo ventral del embrión y retire el tejido meníngeo con pinzas y un cuchillo de microdisección.

Diseccionar los núcleos CN3 y CN4 bilaterales positivos para GFP lejos de la placa del piso y otros tejidos circundantes positivos para GFP, teniendo cuidado de evitar tocar o dañar las neuronas. Si recolecta núcleos CN3 y CN4 separados, corte a lo largo del mesencéfalo de estos dos núcleos y use una pipeta P1000 para recolectar el tejido ventral diseccionado del mesencéfalo con un mínimo de HBSS.

Colóquelo en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros etiquetado lleno de medio de disección. Guarde el tubo en hielo hasta la disociación. Continúe agrupando los mesencéfalos ventrales de embriones adicionales en el mismo tubo hasta que el número total cumpla con los requisitos experimentales.

Para diseccionar la médula espinal ventral, mantenga el embrión boca abajo con la cabeza hacia el frente del microscopio. Sosténgalo con un par de pinzas e inserte la punta del otro par en la parte caudal sin abrir del cuarto ventrículo. Abrir el resto del rombencéfalo y la médula espinal dorsalmente sobre toda la extensión rostrocaudal del embrión. Cortar el tejido dorsal comenzando desde el cuarto ventrículo y trabajando hacia el canal central de la médula espinal caudal, usando las pinzas como tijeras.

Luego, sostenga el embrión con un juego de pinzas y pellizque el colgajo del tejido dorsal a cada lado con el otro par. Retire la médula espinal ventral usando el cuchillo de microdisección para perforar directamente debajo del SMN positivo para GFP, levantando la médula espinal ventral con movimientos similares a una sierra en ambos lados.

Corte la médula espinal transversalmente en el límite superior de la extremidad inferior y retire la porción cervical lumbar. Corte transversalmente directamente por encima de C1 donde se proyecta el primer cuerno anterior positivo para GFP. Coloque la médula espinal ventral con el lado dorsal hacia arriba y sosténgala presionando el tejido GFP negativo entre las columnas SMN positivas para GFP con un par de pinzas.

Retire el mesénquima, los DRG y la médula espinal dorsal restantes recortando ambos lados de la columna SMN positiva para GFP con el cuchillo de microdisección. Use una pipeta P1000 para recolectar el tejido de la médula espinal ventral diseccionado con un mínimo de HBSS y colóquelo en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros marcado lleno de medio de disección. Guárdelo en hielo hasta la disociación y continúe acumulando las médulas espinales ventrales de embriones adicionales en el mismo tubo.

Agregue el volumen apropiado de solución de papaína a cada uno de los tubos de microcentrífuga con las muestras de tejido disecadas. Incube los tubos a 37 grados centígrados durante 30 minutos, agitando los tubos cada 10 minutos moviendo los dedos.

Después de la incubación, triture suavemente cada suspensión ocho veces con una pipeta P200. Centrifugarlo a 300 veces g durante cinco minutos. Vuelva a suspender los gránulos celulares con el volumen adecuado de solución inhibidora de ovomucoides de albúmina pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Repita la centrifugación. A continuación, retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta P1000. Vuelva a suspender las células en el volumen apropiado de medio de disección. Filtre las suspensiones a través de filtros celulares de 70 micrómetros.

A continuación, utilice la clasificación FACS para aislar las células positivas para GFP diseccionadas de CN3, CN4 y SMN. Diluya las suspensiones celulares aisladas con medio de cultivo de neuronas motoras precalentado a 37 grados Celsius a las densidades apropiadas y agregue 200 microlitros de la suspensión a un pocillo de una placa de 96 pocillos recubierta de laminina PDL. Cultive las neuronas en una incubadora de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono, asegurándose de actualizar el medio de cultivo de neuronas motoras cada cinco días.