Purificación de células precursoras endoteliales CD31⁺ mediante clasificación de células activadas magnéticamente

Tome un cultivo adherente de células progenitoras endoteliales o EPC, precursoras de las células endoteliales microvasculares del cerebro.

El cultivo, obtenido mediante la diferenciación de células madre pluripotentes, comprende EPC positivas para el marcador de superficie CD31 y células contaminantes CD31 negativas.

Incubar con un reactivo de disociación para desprender las células y filtrar para obtener una suspensión unicelular.

Agregue un medio para neutralizar las enzimas, centrifugar para desechar el sobrenadante y volver a suspender las células en un tampón.

Incubar con un reactivo bloqueador para inhibir los receptores celulares Fc, evitando el marcaje inespecífico.

Agregue un anticuerpo conjugado con fluoróforo específico para CD31 e incube para marcar los EPC.

Centrifugar y desechar los anticuerpos no unidos. Incubar con complejos de anticuerpos que contienen un anticuerpo que se une a los fluoróforos.

Introducir nanopartículas magnéticas recubiertas de polímero e incubar, permitiendo que las nanopartículas se unan al segundo anticuerpo de los complejos.

Usando un campo magnético, aísle las células unidas a nanopartículas.

Deseche la suspensión con células CD31 negativas no marcadas y vuelva a suspender las células purificadas en un medio. Los EPC CD31 positivos están listos para ensayos posteriores.

En el día 5 del cultivo de células progenitoras endoteliales, aspire el medio de los pocillos y agregue 1 mililitro de reactivo de disociación a cada pocillo. Incube la placa durante 6 a 8 minutos a 37 grados centígrados. Usando una micropipeta, disociar y singularizar las células, luego, pasar la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 micrómetros para filtrarla en un tubo de 50 mililitros que contiene 10 mililitros de medio DMEM / F-12.

Para detener la reacción de digestión, agregue DMEM / F-12 / 10 10 medio hasta la marca de 50 mililitros. Pipetear bien y reservar 10 microlitros para contar las células. Centrifugar el tubo de 50 mililitros a 200 g durante 5 minutos a 20 a 25 grados centígrados para granular las células. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular con 10 mililitros de medio DMEM / F-12/10.

Transfiera la suspensión celular a un tubo nuevo de 15 mililitros. Centrifugar a 200 g durante cinco minutos a 20 a 25 grados centígrados para volver a granular las células. Luego, vuelva a suspender el sedimento celular en el tampón de flujo 1. A continuación, agregue el reactivo de bloqueo de FcR en una proporción de 1 a 100 e incube durante 5 minutos. Luego, agregue el isotiocianato de fluoresceína diluido de proporción de 1 a 200 o el anticuerpo CD31 marcado con FITC.

Incubar la suspensión durante 30 minutos en la oscuridad a una temperatura entre 20 y 25 grados centígrados. Al final de la incubación, agregue 10 mililitros de tampón de flujo 1 a la muestra y reserve 10 microlitros de la suspensión para el análisis de citometría de flujo para determinar la fracción de células CD31 positivas. Centrifugar las células a 200 g durante 5 minutos a 20 a 25 grados centígrados. Después de la centrifugación, vuelva a suspender las celdas con una solución de tampón de flujo 1.

A continuación, agregue 5 microlitros del cóctel de selección FITC por cada 100 microlitros de la suspensión celular. Mezcle bien la solución pipeteando e incube en la oscuridad durante 15 minutos a una temperatura entre 20 y 25 grados centígrados. A continuación, agregue 5 microlitros de nanopartículas magnéticas por cada 100 microlitros de suspensión celular. Pipetea bien la mezcla e incuba en la oscuridad durante 10 minutos a 20 a 25 grados centígrados.

Transfiera la suspensión celular a un tubo de citometría de flujo de 5 mililitros y agregue el tampón de flujo 1 para obtener un volumen total de 2,5 mililitros. Luego, coloque el tubo de citometría de flujo en el imán durante cinco minutos. En un movimiento continuo, invierta el imán y decante la suspensión celular que contiene células no marcadas con anticuerpos FITC-CD31. Mantenga el imán y el tubo en la posición invertida durante 2 a 3 segundos y luego retire el líquido restante.

Aspire las gotas en el borde del tubo antes de volver a colocar el tubo en posición vertical. Recupere el tubo de citometría de flujo del imán y agregue 2,5 mililitros de tampón de flujo 1 para lavar las células CD31 positivas restantes. Pipetea suavemente las células hacia arriba y hacia abajo, dos o tres veces para volver a suspenderlas. Luego, coloque el tubo de flujo en el imán durante cinco minutos.

Repita el lavado al menos cuatro veces para eliminar las células FITC-CD31 sin marcar del tubo. Retire el tubo de flujo del imán y vuelva a suspender las células CD31 positivas purificadas con la cantidad deseada de un medio adecuado. Reserve dos alícuotas de 1 microlitro de la suspensión, una para el recuento celular y la segunda para realizar análisis de citometría de flujo para evaluar la pureza de las células CD31 positivas en muestras de clasificación de células activadas postmagnéticas.