Diferenciación de células madre neurales humanas en progenitores neurales y astrocitos

Comience con neuroesferas no adherentes, un agregado tridimensional de células madre neurales humanas en un medio condicionado derivado de cultivos celulares.

Este medio contiene nutrientes, factores de crecimiento y componentes de la matriz extracelular que mantienen la viabilidad celular.

Centrifugar para recoger las neuroesferas.

Trátelos con tripsina y enzimas ADNasa, mezcle el contenido y luego incube.

La tripsina interrumpe la adhesión de célula a célula y facilita el desprendimiento celular, mientras que la ADNasa degrada el ADN libre para evitar la aglomeración celular.

Pipetear el contenido repetidamente para formar una suspensión unicelular. Luego, agregue un inhibidor de tripsina para neutralizar la actividad enzimática.

Centrifugar y eliminar el sobrenadante, y luego volver a suspender las células en un medio de proliferación que contenga factores de crecimiento neural.

Siembre la suspensión celular en un cubreobjetos recubierto de polímero colocado en una placa de pocillos múltiples. Incubar para permitir que la célula madre se adhiera al polímero.

Además, basándose en la absorción de factores de crecimiento específicos, las células madre se diferencian en progenitores neurales y astrocitos, que están listos para una mayor maduración en tipos de células especializadas.

Después de preparar el medio de cultivo y sembrar las células madre neurales humanas de acuerdo con el protocolo de texto, recupere de la incubadora el matraz de células que se van a pasar y llévelo al gabinete de bioseguridad o BSC. Incline suavemente el matraz, permitiendo que las células se hundan hasta el fondo del medio agrupado.

Transfiera 10 mililitros de medio en dos porciones de 5 mililitros en un tubo limpio de 15 mililitros etiquetado como "CM" para un medio acondicionado. Tenga cuidado de no aspirar ninguna de las células depositadas en el matraz. Transfiera 3 mililitros de medio del tubo CM a un tubo de 15 mililitros etiquetado como "solución inhibidora de tripsina". Luego, deje el tubo CM a un lado.

A continuación, retire los 5 mililitros de medio y las celdas que quedan en el matraz T75 y colóquelo en un tubo limpio de 15 mililitros etiquetado como "celdas". Luego, usando una pipeta serológica y volúmenes de 3,5 mililitros de CM, enjuague el matraz T75 dos veces, transfiriendo el enjuague de CM al tubo de 'células'. Esto eliminará todas las neuroesferas del matraz T75.

Centrifugar el tubo de "células" a 100 veces g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Mientras las células giran, obtenga la solución de glucosa DPBS previamente preparada del baño de agua a 37 grados centígrados y agregue la cantidad adecuada de tripsina y ADNasa.

Después de que el tubo de 'células' haya dejado de girar, retire todo el sobrenadante del medio acondicionado y transfiéralo al tubo CM. Agregue una solución de tripsina al gránulo celular en el tubo de 15 mililitros y use una pipeta de 5 mililitros para pipetear hacia arriba y hacia abajo aproximadamente de 5 a 10 veces. Cierre la tapa del tubo e incube en un baño de agua a 37 grados centígrados durante cinco minutos.

Al tubo inhibidor de tripsina, agregue el volumen apropiado de inhibidor de tripsina, agregando el mismo volumen de solución que se usó para la solución de tripsina. Luego, coloque la solución inhibidora de tripsina en el baño de agua a 37 grados Celsius hasta que la necesite.

Después de la incubación, pipetee las células hacia arriba y hacia abajo de 5 a 10 veces. Luego, incube la muestra en el baño de agua a 37 grados Celsius durante 10 a 15 minutos adicionales. Después de la incubación celular, pipetee las células hacia arriba y hacia abajo hasta que las esferas estén completamente disociadas. Luego, agregue inmediatamente la solución inhibidora de tripsina y pipetee la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo 10 veces.

Para contar el número de células en la suspensión, pipetee 15 microlitros de premezcla de azul de tripano en un pequeño bote de pesaje y agregue 5 microlitros de la suspensión celular. Pipetea hacia arriba y hacia abajo de 3 a 5 veces para mezclar. Luego, transfiera 10 microlitros de la suspensión de células azules de tripano a cada lado de un hemocitómetro, cubierto con un cubreobjetos de vidrio.

Observe las células bajo un microscopio óptico y cuente el número total de células en cada una de las cuatro cuadrículas de las esquinas. Luego, suma estos números. Después de calcular el número de celdas de acuerdo con el protocolo de texto, agregue un volumen de suspensión celular a cada matraz T75 para obtener 5 x 10⁶ celdas por matraz.

Si el volumen es inferior a 5 mililitros, agregue medio acondicionado adicional hasta 5 mililitros. Luego, agregue 10 mililitros de nuevo medio DFHGFPS que contenga factores de crecimiento al matraz. Asegúrese de que el matraz esté etiquetado con el tipo de celdas, las fechas, el número de celdas en el matraz y el número de paso. Si lo desea, incube las células en este punto.

Para colocar placas HNSC adherentes, el día antes de pasar, limpie el BSC como se explica en el protocolo de texto y use fórceps para colocar cubreobjetos de vidrio estériles de 12 milímetros en los pocillos de una placa de 24 pocillos. Cubra los pocillos con cubreobjetos con 250 microlitros por pocillo de poli-D-lisina al 0,01% o PDL en agua estéril e incube las placas a 37 grados centígrados durante una hora. Retire el PDL de los pocillos y luego cúbralos con 1 microgramo por centímetro cuadrado de laminina DPBS.

Incube la placa a 37 grados centígrados durante la noche. Si no es necesario al día siguiente, envuelva el parafilm alrededor de los bordes del plato para sellarlo y guárdelo a 4 grados centígrados. Retire cualquier exceso de solución de laminina de los pocillos mediante aspiración y use 0,5 mililitros de DPBS para enjuagar los pocillos una vez. Luego, siembre las células en cada pocillo a una densidad de 0.6 a 1 x 10⁵ células por centímetro cuadrado.