Generación de organoides cerebrales de tipo prosencéfalo a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Comience con una placa de pocillos de baja adhesión que contenga células madre pluripotentes inducidas por humanos o iPSC en un medio de células madre suplementado con un inhibidor de la Rho-quinasa.

Los inhibidores ingresan a las células, bloquean las enzimas Rho-quinasa y mantienen la viabilidad celular. Esto promueve la formación de agregados de iPSC.

Reemplace el medio con un medio de células madre para permitir que crezcan los agregados. Transfiéralos a una placa de cultivo de baja adherencia con un medio de inducción cortical.

Los componentes de este medio hacen que las iPSC se diferencien en células neuroectodérmicas, un precursor neural.

Transfiera cada agregado neuroectodérmico a una película con pocillos poco profundos.

Reemplace el medio con una matriz de membrana basal e incube para permitir la solidificación de la matriz y el atrapamiento de agregados.

Transfiera estos agregados incrustados en la matriz a un plato que contenga un medio de inducción cortical e incube con agitación.

Con el tiempo, las células neuroectodérmicas utilizan los factores de diferenciación y se convierten en células neuroepiteliales.

Cambie el medio a un medio de diferenciación de organoides, que permite que las células maduren en tipos de células más especializadas, formando un organoide cerebral que se asemeja a la corteza del cerebro anterior.

Para generar agregados de células madre pluripotentes, cuando los cultivos de células madre alcancen una confluencia del 70% al 90%, agregue 500 microlitros de reactivo de disociación celular a un pocillo de la placa de cultivo de seis pocillos para separar las células.

Las células madre pluripotentes inducidas, que se adaptan a las condiciones de cultivo monocapa, son un buen tipo de célula para generar agregados, ya que son menos propensas a la muerte celular inducida por el estrés durante el procedimiento de disociación y agregación.

Después de 5 a 10 minutos a 37 grados centígrados, golpee suavemente la placa y use 2 mililitros de DMEM / F-12 para lavar las células del fondo del pocillo. Transfiera la suspensión celular resultante a un tubo cónico de 15 mililitros y eleve el volumen de la solución celular a 10 mililitros con más medio DMEM / F-12.

Después del recuento, transfiera 4,5 veces 10 a las terceras células por agregado de células madre pluripotentes en un nuevo tubo de 15 mililitros y recoja las células por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en el volumen apropiado de medio de células madre pluripotentes, suplementado con 50 inhibidores micromolares de ROCK para lograr 4,5 x 10³ células por 150 microlitros de concentración de medio.

A continuación, agregue 150 microlitros de células a pocillos individuales de una placa de fondo en U de baja fijación de 96 pocillos y coloque la placa en una incubadora de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Para monitorear la inducción del neuroectodermo anterior, use un microscopio de cultivo de tejidos para observar de cerca los cambios morfológicos de los agregados de células madre pluripotentes todos los días con bajo aumento.

En el día 1, se deben observar agregados celulares con bordes claros. El día 2, aspire cuidadosamente aproximadamente 2/3 del medio sin alterar los agregados celulares en el fondo de cada pocillo y reemplace el medio desechado con 100 microlitros de medio de células madre pluripotentes frescas.

Entre cuatro y seis días después, cuando los agregados celulares alcancen de 350 a 450 micrómetros de diámetro y exhiban bordes lisos, use una punta de pipeta modificada de 100 microlitros para transferir hasta 20 agregados a una sola placa de cultivo de 6 centímetros de baja adherencia que contenga 5 mililitros de medio de inducción cortical.

Reemplace el medio de inducción cortical con medio fresco una vez cada tres días, monitoreando la morfología de los agregados diariamente bajo el objetivo 4x. Después de cuatro a cinco días en el medio de inducción cortical, los bordes de los agregados celulares deberían comenzar a brillar en la superficie, lo que indica diferenciación neuroectodérmica, y debería emerger la organización radial de un epitelio pseudoestratificado.

Para incrustar los agregados neuroectodérmicos en un andamio de matriz, llene un extracto de membrana basal en hielo durante dos o tres horas. Mientras se descongela el extracto, use tijeras estériles para cortar una película de parafina de plástico en un cuadrado de 4 por 4 centímetros por 16 organoides, y coloque cada pieza de película sobre una bandeja vacía de punta de micropipeta de 100 microlitros.

Presione la película de parafina con la yema del dedo enguantado para que aparezcan pequeños hoyuelos y limpie la película con etanol al 70%. Después de la irradiación UV en una cabina de bioseguridad cerrada y estéril durante 30 minutos, use una punta de pipeta modificada de 100 microlitros con una abertura de 1 y 1/2 a 2 milímetros para transferir cada agregado celular a un hoyuelo en la película.

Cuando se hayan transferido todos los agregados, use una punta de pipeta de 100 microlitros sin cortar para aspirar cuidadosamente el medio de cada hoyuelo y agregue 40 microlitros de extracto de membrana basal sin diluir a cada agregado celular.

Tenga cuidado de no dañar los organoides mediante una manipulación brusca o aspiración en la punta de la pipeta, ya que esto dañará el neuroepitelio en desarrollo.

Use la punta de la pipeta para colocar los agregados en el medio de cada gota y use pinzas estériles para transferir cuidadosamente la lámina de película de parafina de plástico a una placa de Petri de 10 centímetros. Coloque el plato en la incubadora durante 15 a 20 minutos.

Mientras el extracto se solidifica, agregue 5 mililitros de medio de inducción cortical fresco a una placa de cultivo de seis centímetros con baja adhesión. Al final de la incubación, voltee la hoja de película de parafina y use pinzas estériles para exprimir suavemente hasta 16 gotas polimerizadas en cada plato de 6 centímetros. Luego, devuelva los agregados a la incubadora de cultivos celulares.

Al día siguiente, transfiera las placas de cultivo de organoides a un agitador de cultivo celular oscilante inclinado en un ángulo de 5 grados a 14 RPM dentro de una incubadora de cultivo celular con monitoreo diario de microscopía de luz hasta que los agregados alcancen la etapa de diferenciación de interés.